Kombinera mitotiska Cell synkronisering och hög upplösning konfokalmikroskopi att studera rollen av multifunktionella cellcykelns proteiner under Mitos
Summary
Vi presenterar ett protokoll för dubbel tymidin synkronisering av HeLa cells följt av analys med hög upplösning konfokalmikroskopi. Denna metod är nyckeln till att få stort antal celler som fortsätter synkront från S fas till Mitos, möjliggör studier på mitotiska roller av multifunktionella proteiner som också äger interphase funktioner.
Abstract
Studie av de olika reglerande händelserna av cellcykeln i ett fas-beroende sätt ger en klar uppfattning om celltillväxt och delning. Synkroniseringen av cellpopulationer på specifika faser av cellcykeln har visat sig vara mycket användbar i sådana experimentella strävanden. Synkronisering av celler genom behandling med kemikalier som är relativt mindre giftiga kan vara fördelaktiga över användning av farmakologiska hämmande läkemedel för studiet av åtföljande cellcykeln händelser och att få viss anrikning av valda mitotiska stadier. Här beskriver vi protokollet för synkronisering mänskliga celler i olika stadier av cellen, inbegripet både i S och M fas med en dubbel tymidin block och släppa förfarande för att studera funktionaliteten i mitotiska proteiner i kromosom justering och segregation. Detta protokoll har varit mycket användbart för att studera de mitotiska rollerna av multifunktionella proteiner som äger etablerade interphase funktioner. I vårt fall, kan Cdt1, ett protein som är kritiska för replikering ursprung licensiering i G1-fasen, mitotiska roll studeras effektivt endast när G2/M-specifika Cdt1 kan vara uttömda. Vi beskriver det detaljerade protokollet för utarmning av G2/M-specifika Cdt1 med dubbel tymidin synkronisering. Vi också förklara protokollet av cell fixering, och lever cellen avbildning med hög upplösning konfokalmikroskopi efter tymidin release. Metoden är också användbar för att analysera funktionen av mitotiska proteiner under både fysiologiska och perturbed tillstånd såsom för Hec1, en komponent i Ndc80 komplex, eftersom det gör det möjligt för en att få stora urvalsstorlekar mitotiska cellernas för fasta och levande cell analys som vi visar här.
Introduction
I cellcykeln genomgår celler en rad starkt reglerade och temporally kontrollerade händelserna för korrekt dubblering av sin arvsmassa och spridning. Hos däggdjur består cellcykeln av interphase och M-fas. I interphasen, som består av tre stadier – G1, S, och G2, cellen dubbletter dess arvsmassa och genomgår tillväxt som krävs för normala cellcykelns förlopp1,2. I den M-fasen, som består av Mitos (profas, metafasen, metafas, Anaphasen och Telophasen) och cytokines, producerar en Föräldrakontroll cell två genetiskt identiska dotterceller. I Mitos, Syster kromatiderna av duplicerade genomet är kondenserad (profas) och fångas på deras kinetochores av mikrotubuli av monterade mitotiska spindeln (metafasen), som driver deras justering på metafas plattan (metafas) följt av deras lika segregation när syster kromatiderna är split mot och transporteras till motsatt spindeln stolpar (anaphase). De två dottercellerna är fysiskt åtskilda av aktiviteten av en aktin-baserade kontraktila ring (Telophasen och cytokines). Kinetochor är en specialiserad proteinhaltiga struktur som monterar på regionen centromeric i kromatiderna och tjäna som bifogad fil platser för spindeln mikrotubuli. Dess huvudsakliga funktion är att köra kromosom fånga, justering, och stöd i korrigera felaktig spindeln mikrotubulära fastsättning, medan medla spindel montering checkpoint för att bibehålla trohet av kromosom segregation3,4.
Tekniken med cell synkronisering fungerar som ett idealiskt verktyg för att förstå händelserna molekylär och strukturell inblandade i cellcykelns förlopp. Detta tillvägagångssätt har använts för att berika cellpopulationer på specifika faser av olika typer av analyser, inbegripet profilering av genuttryck, analyser av cellulära biokemiska processer och detektion av subcellulär lokalisering av proteiner. Synkroniserade däggdjursceller kan användas inte bara för studier av enskilda genen produkter, men också för metoder som omfattar analys av hela genomet inklusive microarray analys av gene expression5, miRNA uttryck mönster6, translationell förordning7och proteomiska analys av protein ändringar8. Synkronisering kan också användas för att studera effekterna av genuttryck eller protein knock-down eller knock-out eller kemikalier på cellcykelns förlopp.
Celler kan synkroniseras vid de olika stadierna av cellcykeln. Både fysiska och kemiska metoder används allmänt för cell synkronisering. De viktigaste kriterierna för cell synkronisering är att synkroniseringen ska vara noncytotoxic och reversibla. På grund av de potentiella negativa cellulära konsekvenserna av synkronisera celler av farmakologiska agenter, kan kemisk-beroende metoder vara fördelaktiga för att studera viktiga cellcykeln händelser. Till exempel, hydroxyurea, amphidicolin, mimosine och lovastatin, kan användas för cell synkronisering på G1/S fas men, på grund av deras effekt på de biokemiska vägar de hämmar, de aktivera cellcykeln checkpoint mekanismer och döda en viktig bråkdel av celler9,10. Däremot, kan feedback hämning av DNA-replikering genom att lägga till tymidin tillväxtmassmedia, känd som ”tymidin block”, arresterar cellcykeln på vissa punkter11,12,13. Cellerna kan också synkroniseras på G2/M fas genom att behandla med nocodazole och RO-33069,14. Nocodazole, som förhindrar mikrotubulära församling, har en relativt hög cytotoxicitet. Dessutom kan nocodazole-arresterade celler återgå till interphase precociously av mitotiska slirning. Dubbla tymidin block gripandet celler på G1/S fas och efter frisläppandet från blocket, celler finns för att fortsätta synkront genom G2 och in Mitos. Den normala progressionen av cellcykeln för celler frigörs från tymidin block kan observeras under hög upplösning konfokalmikroskopi genom cell fixering eller levande imaging. Effekten av störning av mitotiska proteiner kan studeras specifikt när celler anger och vidare genom Mitos efter frisläppandet från dubbel tymidin block. Cdt1, ett multifunktionellt protein, är involverad i DNA replication ursprung licensiering i fasen G1 och krävs också för Kinetochor mikrotubulära bilagor under Mitos15. För att studera funktionen av Cdt1 under Mitos, måste man införa en metod som undviker effekten av dess utarmning på replikering licensiering under G1-fasen, medan samtidigt verkställer dess utarmning bestämt under den G2/M-fasen bara. Här presenterar vi detaljerade protokoll baserat på dubbel tymidin blocket att studera proteiner som utför flera funktioner under olika faser av cellcykeln mitotiska roll av både fasta och live-cell imaging.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mest kritiska fördelen av dubbla tymidin synkronisering är att det ger en ökad provstorlek av mitotiska celler i en kort tidsfönster med många av dessa celler att ange Mitos unisont, vilket också möjliggör analyser av kromosom justering, bipolär spindel bildandet och kromosomsegregering med mycket högre effektivitet.
Många reglerande proteinkomplex och signalvägar ägnas åt att säkerställa normala progression genom Mitos och avregleringen av denna process kan lett till tumourige…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma till Dr Kozo Tanaka Tohoku University i Japan för att dela HeLa cells stabilt uttrycker mCherry-histonglykoprotein H2B och GFP-α-tubulin. Detta arbete stöddes av en NCI grant till DV (R00CA178188) och av nystartade fonder från Northwestern University.
Materials
| DMEM (1X) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 degree C |
| DPBS (1X) | Life Technologies | 14190-144 | Store at 4 degree C |
| Leibovitz’s (1X) L-15 medium | Life Technologies | 21083-027 | Store at 4 degree C |
| Serum reduced medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 319-85-070 | Store at 4 degree C |
| Penicillin and streptomycin | Life Technologies | 15070-063 (Pen Strep) | 1:1000 dilution |
| Dharmafect2 | GE Dharmacon | T-2002-02 | Store at 4 degree C |
| Thymidine | MP Biomedicals LLC | 103056 | Dissolved in sterile distiled water |
| Cdt1 siRNA | Life Technologies | Ref 10 | |
| Hec1 siRNA | Life Technologies | Ref 13 | |
| HeLa cells expressing GFP-H2B | |||
| HeLa cells expressing GFP-α-tubulin and mCherry H2B | Generous gift from Dr. Kozo Tanaka of Tohoku university, Japan | ||
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich Corporation | F8775 | Toxic, needs caution |
| DAPI | Sigma-Aldrich Corporation | D9542 | Toxic, needs caution |
| Mouse anti-α-tubulin | Santa Cruz Biotechnology | Sc32293 | 1:1000 dilution |
| Rabbit ant-Zwint1 | Bethyl | A300-781A | 1:400 dilution |
| Mouse anti-phospho-γH2AX (Ser139) | Upstate Biotechnology | 05-626, clone JBW301 | 1:300 dilution |
| Alexa 488 | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| Rodamine Red-X | Jackson ImmunoResearch | 1:250 dilution | |
| BioLite 6 well multidish | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| 35MM Glass bottom dish | MatTek Corporation | P35GCOL-1.5-14-C | |
| Nikon Eclipse TiE inverted microscope | Nikon Instruments | ||
| Spinning disc for confocal | Yokagawa | CSU-X1 | |
| Ultra 888 EM-CCD Camera | Andor | iXon Ultra EMCCD | |
| 4 wave length laser | Agilent Technologies | ||
| Incubation System for Microscopes | Tokai Hit | TIZB | |
| NIS-elements software | Nikon Instruments |
References
- Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
- Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
- Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).
- Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6 (1), E5 (2017).
- Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).
- Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).
- Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
- Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).
- Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).
- Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).
- Amon, A. Synchronization procedures. Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).
- Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).
- Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
- Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
- Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).
- Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).
- Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).
- Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
- Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12 (4), e0174819 (2017).
- Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).
- Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).
