Isolering av Salmonella typhimurium-innehållande Phagosomes från makrofager
Summary
Vi beskriver här en enkel och snabb metod för isolering av Salmonella typhimurium-innehållande phagosomes från makrofager beläggning bakterierna med biotin och streptividin.
Abstract
Salmonella typhimurium är en fakultativt intracellulär bakterie som orsakar gastroenterit hos människor. Efter invasionen av lamina propria, S. typhimurium bakterier snabbt upptäcks och phagocytized av makrofager, och som ingår i blåsor som kallas phagosomes för att degraderas. Isolering av S. typhimurium-innehållande phagosomes har använts i stor utsträckning att studera hur S. typhimurium infektion förändrar processen av phagosome mognad att förhindra bakteriell nedbrytning. Klassiskt, isolering av bakterier-innehållande phagosomes har utförts av sackaros gradient centrifugering. Men denna process är tidskrävande och kräver specialutrustning och viss fingerfärdighet. Beskrivs här är en enkel och snabb metod för isolering av S. typhimurium-innehållande phagosomes från makrofager beläggning bakterierna med biotin-streptividin-konjugerad magnetiska pärlor. Phagosomes som erhålls med denna metod kan avbrytas i någon buffert val, så att utnyttjandet av isolerade phagosomes för ett brett spektrum av analyser, såsom protein, metabolit och lipid analys. Sammanfattningsvis, denna metod för isolering av S. typhimurium-innehållande phagosomes är specifika, effektiv, snabb, kräver minsta utrustning och är mer mångsidig än den klassiska metoden för isolering av sackaros gradient-ultracentrifugering.
Introduction
Makrofager cirkulerande specialiserade Fagocytos celler som upptäcka, uppsluka och försämra någon främmande partikel i perifera vävnader, alltifrån apoptotiska celler till invaderande mikroorganismer såsom bakterier. Vid ytan receptormedierad erkännande av patogen specifika markörer ofta finns på ytan av mikroorganismer (känd som patogen-associerade molekylära mönster eller PAMPs), initiera makrofager en komplicerade omorganiseringen av cellulära membran i för att omringa och fagocytera patogen1.
Uppslukas patogen då innehålls av makrofager i en intracellulär vesikler som kallas phagosome. Genom en serie av fusion och fission händelser med andra blåsor som endosomes och lysosomer förvärvar patogen-innehållande phagosome en uppsättning av proteiner som krävs för eliminering av phagosomal innehåll. Enzymatisk sammansättningen av phagosome är därför mycket varierande under denna process, som kallas phagosome mognad2.
Strax efter fagocytos, den multimeric komplexa vakuolär ATPas (v-ATPas) införlivas i den phagosome membranen av fusion med endosomes3. Detta komplex använder tredjeparts ATP till pumpen protoner från cytosolen till lumen av phagosome4. Försurning av phagosome är viktigt för fusion händelser med andra blåsor5 och för aktivering av ett stort antal pH-beroende nedbrytningsvägar enzymer6. En annan multimeric enzymatisk komplex som monteras snabbt på phagosome membranet är NADPH-oxidas (NOX) komplex. NOX komplexa oxiderar NADPH för att producera reaktiva syreradikaler (ROS) som utsöndras i phagosome lumen och som väsentligt bidrar till dödandet av uppslukas mikroorganismer7.
Under de första stegen av mognad presenterar phagosomes markörer vanligtvis såsom Rab5 och Rab7 av tidiga och sena endosomes respektive tillsammans med den V0 subuniten av v-ATPas8. Fusion av phagosomes med lysosomer och sena endosomes resulterar i fagocyterat patogenen exponering för ett brett utbud av Hydrolytiska enzymer som cathepsin proteaser, lipaser och β-galaktosidas9. Försurning av lumen krävs också för aktivering av dessa enzymer. Exempelvis är klyvning av cathepsin D att producera den aktiva korta formen pH-beroende10. Dessa enzymer försämras patogenen och förmedlar produktion av patogen-derived kort peptider som presenteras av de makrofag stora histocompatibility komplex (MHC) klass II molekylerna att T-celler att utlösa en adaptiva immunsvaret11.
Därför phagosome mognad är avgörande för medfödda immunsvaret och länkar medfödd och adaptiv armarna av immunsystemet. Det är ingen överraskning att patogener har utvecklats strategier för att övervinna eliminering av makrofager genom den ovan beskrivna processen av phagosome mognad. Exempelvis hindra de intracellulära bakterierna Mycobacterium tuberculosis och Legionella pneumophila phagosome mognad av hämmande v-ATPas montering och åtföljande lumen försurning12,13 . Andra bakterier, till exempel Listeria monocytogenes eller Shigella flexneri framkalla pore bildas i phagosome membranet att fly till cytosolen14,15. Å andra sidan, Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) kan ändra egenskaperna för phagosome inom den vakuol omvandla den till en lämplig plats för dess replikering16. Denna förmåga gör S. typhimurium en mycket intressant modell för att studera patogen-medierad störningar av phagosome mognad.
S. typhimurium är en fakultativt intracellulär bakterie som orsakar gastroenterit hos människor. Efter invasionen av lamina propria, S. Typhimurium bakterier snabbt upptäcks och phagocytized av makrofager, och som ingår i phagosomes17. Vissa rapporter har tidigare beskrivit att S. typhimurium-innehållande phagosomes presentera beslutsfattare för både endosomes och lysosomer18, och andra studier har funnit phagosome-Lysosomen fusion förhindras vid S. Typhimurium infektion19.
Inledningsvis phagosome mognad vid S. typhimurium infektion har undersökts med hjälp av immunofluorescens mikroskopi. Utvecklingen av teknik för isolering av bakterier-innehållande phagosomes aktiverat en noggrannare studie av phagosome innehållet när det gäller endosome och Lysosomen markörer. Hittills är den huvudsakliga metoden som används för isolering av bakterier-innehållande phagosomes är den subcellulär fraktioneringen på sackaros steg övertoningar18,20. Denna metod kräver dock flera centrifugering steg som kan orsaka mekaniska skador på phagosomes, kan påverka stabiliteten i phagosomal komponenter (proteiner och lipider) och är tidskrävande. Dessutom, det kräver användning av en ultracentrifugen: specialiserad utrustning som inte är tillgänglig för varje laboratorium.
Nyligen har en ny strategi har tillämpats på isoleringen av bakteriell-innehållande phagosomes, där bakteriella patogener är märkta med biotinylerade lipopetide (Lipobiotin) och senare extraheras med hjälp av streptividin-konjugerad magnetiska pärlor21 . Vi föreslår en alternativ kompletterande metod av märkning bakteriella surface amine-innehållande makromolekyler med NHS-Biotin följt av streptividin-konjugerad magnetiska pärlor. Phagosomes som erhålls med denna metod är mycket berikad med endosome och Lysosomen markörer och kan användas för ett brett spektrum av analyser, från proteinanalys omics analys. Dessutom kräver det inte specialutrustning såsom ultracentrifuges. Dessutom genom att eliminera centrifugering stegen, är både den mekaniska skadan phagosomes och mängden tid som anställd betydligt lägre. Denna metod kan lätt anpassas för isolering av phagosomes som innehåller andra bakterier, såsom den grampositiva stafylokocker, också ingår i detta manuskript. Sammanfattningsvis, denna metod för isolering av S. typhimurium-innehållande phagosomes är en enkel, kostnadseffektiv och mindre tidskrävande än den klassiska isoleringen av sackaros gradient-ultracentrifugering, rendering högt berikad bakterier-innehållande phagosomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
En ny metod för isolering av S. typhimurium-innehållande phagosomes beläggning bakterierna med biotin och streptividin-konjugerad magnetiska pärlor beskrivs här. Efter varsam avbrott i cellmembranet, kan som innehåller bakterier phagosomes enkelt utvinnas med hjälp av en magnetisk rack. Vi visar att märkning av bakterierna bevarar patogenen förmåga att inducera inflammation och ändrar inte egenskapen fagocytos av värdcellen. Allt phagosomes som erhålls med denna metod är berikad med bakter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i Robinson’s lab stöds av finansiering från Köln Excellence kluster på cellulär Stress svaren i Aging-Associated sjukdomar, universitetet i Köln, Tyskland (CECAD; finansieras av DFGEN inom Excellence initiativ av den tyska federalt och statliga regeringar) och anslag från Deutsche Forschungsgemeinschafts (SFB 670), Köln Fortune och Maria-Pesch Foundation vid universitetet i Köln, Tyskland.
Materials
| EZ-Link NHS Biotin | Thermo Fisher Scientific | 20217 | |
| FluidMag Streptavidin | Chemicell | 4205 | |
| PIPES | Carl Roth | 9156.2 | |
| MgCl2 | Carl Roth | A537.4 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | |
| Mannitol | Carl Roth | 4175.1 | |
| DTT | Sigma | 43816 | |
| Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Fisher Scientific | 1861280 | |
| Cytochalasin B | Sigma | C6762 | |
| DYNAL or DynaMag Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| SmartSpec 3000 Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2501 | |
| Bacterial loop (10µl) | Sarstedt | 86.1562.010 | |
| Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 | Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures | ||
| RPMI | Biochrom | FG1415 | |
| PBS | Biochrom | L1825 | |
| Cy5-streptavidin | Invitrogen | SA1011 | |
| anti-beta-actin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| anti-mCherry antibody | Thermo Fisher Scientific | PA5-34974 | |
| anti-Rab5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46692 | |
| anti-Rab7 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-10764 | |
| anti-v-ATPase (V0) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-28801 | |
| anti-v-ATPase (V1) antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20943 | |
| anti-cathepsin D antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-6486 | |
| anti-Tomm20 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17764 | |
| anti-calnexin antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-46669 | |
| anti-GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-20357 |
References
- Freeman, S. A., Grinstein, S. Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton. Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).
- Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization. Plos One. 3 (7), e2758 (2008).
- Forgac, M. Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology. Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium. Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology. Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).
- Haas, A. The phagosome: Compartment with a license to kill. Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).
- Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: A few bugs in the system. J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).
- Turk, V., et al. Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers. Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).
- Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing. Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).
- Robinson, N., et al. Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response. Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7. Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).
- Smith, G. A., et al. The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread. Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane. J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).
- Ohl, M. E., Miller, S. I. Salmonella: A model for bacterial pathogenesis. Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).
- Mills, S. D., Finlay, B. B. Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded. Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).
- Buchmeier, N. A., Heffron, F. Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium. Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).
- Luhrmann, A., Haas, A. A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages. Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).
- Steinhauser, C., et al. Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes. Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy. Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).
- Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages. Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes. Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).
- Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections. Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).
- Rogers, L. D., Foster, L. J. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).
