طريقة فعالة وبسيطة وضع ناغورني كاراباخ وخطوط الخلايا T من المرضى المصابين بالعدوى المزمنة النشطة فيروس ابشتاين-بار
Summary
تم تطوير طريقة بسيطة للحصول على استنساخ ناغورني-كاراباخ وخلية T من المرضى كايبف بكفاءة عالية وكمية صغيرة من الدم المحيطي، وجرعة منخفضة من إيل-2.
Abstract
قد وصفت عددا من الأساليب إنشاء خطوط الخلايا ناغورني كاراباخ للطن من المرضى الذين يعانون من مرض سرطان الغدد الليمفاوية أو ليمفاوية. هذه الأساليب تستخدم الخلايا المغذية، وتنقية الخلايا T أو ناغورني كاراباخ مع قدر من 10 مل دم، أو جرعة عالية من إيل-2. هذه الدراسة ويعرض طريقة جديدة مع استراتيجية قوية وبسيطة لإنشاء خطوط ناغورني-كاراباخ وخلية T باستزراع الطرفية الدم الخلايا وحيدات النوى (PBMC) مع إضافة إيل-2 البشري الماشوب (رحيل-2)، ويستخدم أقل من 2 مل دم الكامل. الخلايا يمكن أن تنتشر بسرعة في غضون أسبوعين، ويستمر لمدة أكثر من 3 أشهر. مع هذا الأسلوب، أنشئت خطوط ناغورني كاراباخ أو خلية تي 7 مع نسبة نجاح عالية. هذا الأسلوب بسيطة وموثوق بها، وينطبق على إنشاء خطوط الخلايا من المزيد من حالات سرطان الغدد الليمفاوية الخلية كايبف أو ناغورني كاراباخ/تي.
Introduction
فيروس ابشتاين-بار (EBV) في كل مكان ويصيب ليس فقط خلايا ب، ولكن أيضا تي والطبيعية الخلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل، الذي يسبب عددا من الأمراض المرتبطة EBV ناغورني كاراباخ/تي ليمفاوية (LPD) وسرطان الغدد الليمفاوية/اللوكيميا، مثل هيموفاجوسيتيك EBV المرتبطة ليمفوهيستيوسيتوسيس و extranodal ناغورني كاراباخ/تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية، ونوع الآنف وهيدرا فاكسينيفورمي مثل الأورام اللمفاوية العدوانية ناغورني-كاراباخ خلية اللوكيميا1،،من23. ومن بين هذه هو حادة نشطة EBV (سكايبف) الأمراض المزمنة، وهو الحادث أساسا في شرق آسيا، والذي يعتبر الآن LPD الناجم عن التوسع في الاستنساخ من المصابين EBV T أو ناغورني كاراباخ الخلايا4،5،6، 7، لكن من دون نقص المناعة الظاهر موجودة في كثرة الوحيدات العدوائيه (IM)-مثل الأعراض بما في ذلك الحمى وضخامة وتضخم العقد اللمفية والخلل في الكبد مستمر أو متكرر، فضلا عن ارتفاع EBV-الحمض النووي تحميل في الدم المحيطي8،9. المرضى الذين يعانون من كايبف سوء تشخيص10،11، والمرضية، ودور EBV غير واضح. ولذلك، الخلية الخطوط المشتقة من الأمراض المرتبطة EBV ناغورني كاراباخ/تي ليمفاوية والأورام الليمفاوية مفيدة جداً كنماذج الخلية لتوضيح إليه EBV الناجم عن انتشار الخلايا T أو ناغورني كاراباخ وعلاقتها مع ارتفاع عدد حالات سرطان الدم أو سرطان الغدد الليمفاوية.
وحتى الآن، تم إنشاء العديد من خطوط الخلايا مع تقنيات مختلفة12،،من1314،،من1516. خط خلية بشرية ناغورني-كاراباخ، ناغورني كاراباخ-يس، أنشأت من ناغورني كاراباخ الخلية اللمفاوية/اللوكيميا، استزراع يشترك مع خط خلية stromal ماوس كالتغذية، وحضور رحيل-2 بتركيز 20U كل مل15. KAI3 وكان آخر خط الخلية ناغورني كاراباخ المنشأة من سكايبف مع خط الخلية ليمفوبلاستويد الذاتي (LCL)، أو المرضى الذين يعانون من حساسية شديدة البعوض من الخلايا ب غيرت EBV، كالخلايا المغذية وإضافة لرحيل-2 في 100U/مل16. SNK6 و SNT8 مستمدة من أنسجة الورم الأنفي ناغورني كاراباخ/تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية المرضى عن طريق إضافة جرعة عالية من رحيل-2 (700U/mL)12. مع تقنية مماثلة، وكانت الخلية SNK-1 من المرضى كايبف، مثقف من ببمك عن طريق إزالة خلايا تي ومشيراً إلى 700U/مل من رحيل-213،17. وأنشئت عن طريق إزالة خلايا CD4 + و CD8 + الخلايا18SNT13 و SNT15. حتى الآن، الأخرى خطوط الخلية خلية تي وناغورني كاراباخ من المرضى LPD EBV ناغورني كاراباخ/تي كل ما وضعت مع هذا الأسلوب19.
عيوب الأساليب القائمة المذكورة أعلاه تتضمن توظيف الخلايا المغذية، واشتراط جرعة عالية من إيل-2، والاستفادة من قدر 10 مل كل الدم، أو تنقية الخلايا NK/T، والتي صعبة للغاية في العيادة المقرر أن ضرورة التحقق من أي نوع من أنواع الخلايا أن EBV خفية يصيب قبل بداية للثقافة. كما كايبف يحدث أساسا في الأطفال في آسيا، 10 مل الدم لا يسهل الحصول عليها في جميع المناطق. في هذه الدراسة، قمنا بتطوير طريقة بسيطة جديدة مع نسبة نجاح عالية إنشاء خطوط ناغورني كاراباخ و/أو خلية T باستزراع ببمك من كايبف من المرضى باستخدام جرعة منخفضة من rhIL2 ووحدة تخزين 2 مل من الدم كله دون تغذية الخلايا. وقد أثبتت نتائج هذه الطريقة كفاءة عالية وتوفير الوقت.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وضعت في هذا البروتوكول، تقنية جديدة لإنشاء خطوط الخلايا ناغورني كاراباخ للطن من الدم كله من المرضى كايبف. بالمقارنة مع الأساليب القائمة، والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو بساطته ومتطلباتها فقط كمية صغيرة من الدم، في حين أنه يسلك بمعدل نجاح مرتفع وظروف جيدة لبقاء الخلية. وعلاوة على ذلك…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يؤيد مشاريع مفتاح من الأكاديمية الصينية للعلوم (كفزد-سويسري-205)، “الاستراتيجية البيولوجية موارد تكنولوجيا نظام الدعم للأكاديمية الصينية” للعلوم (كزبزكس-1 وزسب-004)، والمنح من “مؤسسة العلوم الوطنية في الصين” ( 81401640) وشنغهاي صندوق العلوم الطبيعية (14ZR1434800).
Materials
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
References
- Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
- Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
- Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
- Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
- Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency?. Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
- Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
- Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
- Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
- Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
- Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
- Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
- Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
- Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
- Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
- Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
- Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
- Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
- Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
- Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
- Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
- Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
- Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
- Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).
