Une méthode Simple et efficace pour établir les NK et les lymphocytes T lignes provenant de Patients avec une Infection chronique Active Virus Epstein - Barr
Summary
Une méthode simple permettant d’obtenir des clones NK et des lymphocytes T chez des patients CAEBV a été développée avec rendement élevé, une petite quantité de sang périphérique et une faible dose d’il-2.
Abstract
Un certain nombre de méthodes ont été décrit pour établir des lignées de cellules NK/T de patients atteints de syndrome lymphoprolifératif ou de lymphome. Ces méthodes employées des cellules nourricières, les cellules NK ou T purifiées autant que 10 ml de sang ou une dose élevée d’il-2. Cette étude présente une nouvelle méthode avec une stratégie simple et puissante pour établir des lignes NK et des lymphocytes T en cultivant le périphérique du sang des cellules mononucléaires (PBMC) avec l’ajout d’il-2 de recombinante humaine (rhIL-2) et utilise aussi peu que 2 mL de sang total. Les cellules peuvent proliférer rapidement dans les deux semaines et être maintenues pendant plus de 3 mois. Avec cette méthode, 7 lignes de NK ou les lymphocytes T ont été établis avec un taux de réussite élevé. Cette méthode est simple, fiable et applicable à l’établissement de lignées cellulaires de plus de cas de lymphome à cellules NK/T ou de CAEBV.
Introduction
Virus d’Epstein – Barr (EBV) est omniprésent et infecte non seulement B cellules, mais aussi T et natural killer (NK), ce qui provoque un certain nombre de maladies de Syndromes lymphoprolifératifs associés à l’EBV NK/T (LPD) et Lymphome/leucémie, telles que l’activation macrophagique associés à EBV familiale, hydroa vacciniforme type lymphome, lymphome à cellules NK/T extraganglionnaires, type nasal et NK agressive cellule leucémie1,2,3. Parmi ceux-ci est la maladie chronique grave actif EBV (SCAEBV), qui est incident principalement en Asie du sud-est, et qui est maintenant considéré comme un LPD causée par une expansion clonale d’infectées par l’EBV T ou NK cellules4,5,6, 7, mais sans l’immunodéficience apparente présent dans la mononucléose infectieuse (MNI)-comme symptômes, y compris la fièvre, une hépatosplénomégalie, une lymphadénopathie et dysfonction hépatique persistante ou récurrente, ainsi que EBV-ADN haute charge dans la sang périphérique8,9. Patients atteints de CAEBV ont un mauvais pronostic10,11et sa pathogenèse, et ignore le rôle de l’EBV. Donc, lignées dérivées de maladies lymphoprolifératives associés à EBV NK/T de cellules et de lymphomes sont très utiles comme modèles cellulaires pour clarifier le mécanisme d’EBV induit la prolifération NK et des lymphocytes T et sa relation à forte incidence de la leucémie ou lymphome.
A ce jour, plusieurs lignées cellulaires ont été établies avec différentes techniques12,13,14,15,16. Une lignée humaine de cellules NK, NK-YS, créait de leucémie/lymphome à cellules NK, co-culture avec une lignée de cellules stromales de souris comme conducteur et en présence de rhIL-2 à une concentration de 20U par tranche de15mL. KAI3 était une autre lignée de cellules NK, établie à partir de patients présentant une allergie sévère moustique ou SCAEBV avec la lignée lymphoblastoïde autologue (LCL), les lymphocytes B transformés par EBV, sous forme de cellules nourricières et ajout de rhIL-2 à 100U/mL16. SNK6 et SNT8 ont été dérivées de tissus de tumeur nasale patients de lymphome de cellules NK/T en ajoutant de fortes doses de rhIL-2 (700U/mL)12. Avec une technique similaire, la cellule de SNK-1 était de patients CAEBV, cultivées de PBMC en enlevant les cellules T et ajoutant 700U/mL rhIL-213,,17. SNT13 et SNT15 ont été créés en supprimant les CD4 + et CD8 + cellules18. Jusqu’à présent, autres lignées cellulaires de cellules T et NK de patients EBV-NK/T LPD ont tous été conçues avec cette méthode19.
Les inconvénients des méthodes existantes mentionnées ci-dessus comprennent l’emploi de cellules nourricières, l’exigence d’une forte dose de IL-2, l’utilisation d’autant que 10 mL de sang total ou la purification des cellules NK/T, qui est très difficile dans la clinique due à la nécessité de vérifier quels types de cellules que EBV latentes infecte avant de commencer à la culture. CAEBV se produit principalement chez les enfants en Asie, 10 mL de sang n’est pas facile à acquérir dans toutes les régions. Dans cette étude, nous avons développé une nouvelle méthode simple avec un taux de réussite élevé pour établir des lignes NK et des lymphocytes T en cultivant des PBMC de patients CAEBV en utilisant une faible dose de rhIL2 et un volume de 2 mL de sang total sans cellules nourricières. Les résultats de cette méthode ont prouvé sa grande efficacité et gain de temps.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce protocole, une nouvelle technique pour l’établissement de lignées de cellules NK/T de sang des patients CAEBV a été développée. Comparaison avec les méthodes existantes, l’avantage majeur de cette méthode est sa simplicité et son exigence de seulement une petite quantité de sang, alors qu’il présente un taux de réussite élevé et de bonnes conditions de viabilité des cellules. En outre, les lignées de cellules NK/T peuvent être établies en cultivant des PBMC sans déterminer les types de ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la clé des projets de chinois Académie des Sciences (KFZD-SW-205), stratégique biologique ressources technologie système de soutien de chinois Académie des Sciences (CZBZX-1 et ZSSB-004) et par des subventions de la Fondation nationale des sciences de Chine ( 81401640) et Shanghai fonds de sciences naturelles (14ZR1434800).
Materials
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
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