Summary

Un metodo semplice ed efficace per stabilire NK e linee a cellula T da pazienti con infezione attiva cronica del Virus di Epstein - Barr

Published: March 30, 2018
doi:

Summary

Un metodo semplice per ottenere cloni delle cellule T e NK dai pazienti CAEBV è stato sviluppato con alta efficienza, una piccola quantità di sangue periferico e una basso-dose del-2.

Abstract

Un numero di metodi è state descritto per stabilire linee di cellule NK/T da pazienti con sindrome di linfoma o lymphoproliferative. Questi metodi impiegati le cellule di alimentatore, le cellule NK o T purificate per quanto 10 ml di sangue o un’alto-dose del-2. Questo studio presenta un nuovo metodo con una strategia semplice e potente per stabilire linee delle cellule T e NK, coltivando il periferico del sangue cellule mononucleari (PBMC) con l’aggiunta del-2 di umana ricombinante (rhIL-2) e utilizza più di 2 mL di sangue intero. Le cellule possono proliferare rapidamente in due settimane ed essere mantenute per più di 3 mesi. Con questo metodo, 7 linee NK o cellula T sono state stabilite con un alto tasso di successo. Questo metodo è semplice, affidabile e applicabile alla creazione di linee cellulari da più casi di linfoma a cellule NK/T o CAEBV.

Introduction

Virus di Epstein – Barr (EBV) è onnipresente e infetta non solo le cellule di B, ma anche T e cellule natural killer (NK), che provoca una serie di malattie linfoproliferative EBV-associati NK/T (LPD) e linfoma/leucemia, quali hemophagocytic EBV-associati lymphohistiocytosis, Idroa vacciniforme-come linfoma, extranodal linfoma a cellule NK/T, tipo nasale e NK aggressivo delle cellule di leucemia1,2,3. Tra questi è attivo EBV (SCAEBV) la malattia cronica severa, che è incidente principalmente in Asia orientale, e che è ora considerato un LPD causati dall’espansione clonale di EBV-infettate T o NK cellule4,5,6, 7, ma senza l’immunodeficenza apparente presenti nella mononucleosi contagiosa (IM)-come i sintomi compreso febbre, epatosplenomegalia, linfoadenopatia e disfunzione del fegato con insistenza o periodica, nonché alto EBV-DNA carico nella sangue periferico8,9. Pazienti con CAEBV hanno una prognosi difficile10,11e la relativa patogenesi e il ruolo dell’EBV è poco chiaro. Pertanto, le linee derivate da malattie linfoproliferative EBV-associati NK/T cellulari e linfomi sono molto utili come modelli cellulari per chiarire il meccanismo di EBV indotta da proliferazione NK o cellula T e la sua relazione con alta incidenza di leucemia o linfoma.

Ad oggi, parecchie linee cellulari sono state stabilite con diverse tecniche12,13,14,15,16. Una linea di cellule NK umana, NK-YS, è stata fondata da leucemia/linfoma a cellule NK, di co-coltura con una linea di cellule stromali di topo come alimentatore e in presenza di rhIL-2 ad una concentrazione di 20U per mL15. Kai3 era un’altra linea di cellule NK stabilita da pazienti con un’allergia grave zanzara o SCAEBV con linea cellulare autologo linfoblastoidi (LCL), cellule di B trasformate da EBV, come le cellule di alimentatore e aggiunta di rhIL-2 a 100U/mL16. SNK6 e SNT8 sono stati derivati da tessuti tumorali di pazienti di linfoma a cellule NK/T nasali con l’aggiunta della alto-dose di rhIL-2 (700U/mL)12. Con tecnica simile, la cella di SNK-1 era da pazienti CAEBV, coltivati da PBMC rimuovendo le cellule di T e aggiungendo 700U/mL rhIL-213,17. SNT13 e SNT15 sono stati stabiliti tramite la rimozione di CD4 + e CD8 + cellule18. Finora, altre linee cellulari delle cellule T e NK dai pazienti EBV-NK/T LPD sono stati sviluppati con questo metodo19.

Gli svantaggi dei metodi esistenti di cui sopra comprendono l’impiego di cellule di alimentatore, il requisito di un alto-dose del-2, l’utilizzazione di quanto 10 mL di sangue intero o la purificazione delle cellule di NK/T, che è molto impegnativo in clinica a causa la necessità di verificare quali tipi di cella che EBV latente infetta prima di iniziare a cultura. Come CAEBV si verifica principalmente nei bambini in Asia, 10 mL di sangue non è facile acquisire in tutte le regioni. In questo studio, abbiamo sviluppato un nuovo metodo semplice con un alto tasso di successo per stabilire linee NK e/o cellula T coltivando PBMC dai pazienti CAEBV utilizzando una basso-dose di rhIL2 e un volume di 2 mL di sangue intero senza cellule di alimentatore. I risultati di questo metodo hanno dimostrato la sua elevata efficienza e risparmio di tempo.

Protocol

Questo studio è stato approvato dal comitato etico del Istituto di genetica e biologia dello sviluppo, Accademia cinese delle scienze, e il protocollo segue le linee guida istituzionali per benessere umano. Nota: Vedere la Figura 1 per una schematica del flusso di lavoro. 1. isolamento di PBMC dai pazienti CAEBV Purificare il primario PBMC da 2 mL di sangue intero di pazienti CAEBV di sfumatura (ad es., Ficoll-placca…

Representative Results

Dopo 3 giorni cultura durante l’istituzione di linee cellulari, le cellule polimorfiche cominciano ad apparire (Figura 2). Dopo 7 giorni, le cellule crescono rapidamente, come il numero e la vitalità delle cellule sono aumentati ad un ritmo elevato (Figura 3). Piccoli grappoli di cellule sono chiaramente visibili dopo 10-14 giorni in crescita, quando la concentrazione di cellule può superare i 3-6 × 106. In questo p…

Discussion

In questo protocollo, è stata sviluppata una nuova tecnica per l’istituzione di linee di cellule NK/T dal sangue intero dei pazienti CAEBV. Confrontato con i metodi esistenti, il principale vantaggio di questo metodo è la sua semplicità e la sua esigenza di solo un piccolo volume di sangue, mentre esibisce un alto tasso di successo e buone condizioni di attuabilità delle cellule. Inoltre, linee di cellule NK/T possono essere stabilite coltivando PBMC senza determinare i tipi di cellule EBV latente infettati in antici…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da progetti chiave dell’Accademia cinese delle scienze (KFZD-SW-205), strategico biologico risorse tecnologia sistema di supporto dell’Accademia cinese delle scienze (CZBZX-1 e ZSSB-004) e da sovvenzioni dalla National Science Foundation of China ( 81401640) e fondo di scienze naturali (14ZR1434800) di Shanghai.

Materials

Hu HLA-DR FITC BD 560944 antibody for FACS
Hu CD4 FITC BD 555346 antibody for FACS
Hu/NHP CD8 PE BD 557086 antibody for FACS
Hu CD3 PE BD 555340 antibody for FACS
Hu CD16 FITC 3G8 BD 555406 antibody for FACS
Hu/NHP CD56 PE MY31 BD 556647 antibody for FACS
hu/CD19 PE-Cy7 BD 560728 antibody for FACS
human IL-2 Roche 11147528001
human serum MRC CCC118-125
CO2 incubator SANYO
Centrifuge Techcomp CT6T Centrifugation
microscope OLYMPUS CKX53 CKX53
Automated Cell Counter Countstar IC 1000 For cell counting
24 well cell culture cluster Corning Incorporated 3524 Polystyrene plates
25cm2 cell culture flask Nest 707001 Polystyrene
FBS Gibco 10270 Component of cell medium
RPMI Medium 1640 life 22400089 For cell medium
L-Glutamine Amresco 374 Component of cell medium
100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 BioRoYee BRY-2309 Component of cell medium
Ficoll paque plus GE Healthcare 17-1440-03 For in vitro isolation of lymphocyte
DMSO Sigma D2650 For freezing cells
flow cytometer BD BD FACSAria II
soft ware BD BD FACSDiva soft ware FACS analysis

References

  1. Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
  2. Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
  3. Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
  4. Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
  5. Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency?. Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
  6. Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
  7. Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
  8. Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
  9. Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
  10. Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
  11. Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
  12. Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
  13. Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
  14. Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
  15. Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
  16. Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
  17. Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
  18. Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
  19. Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
  20. Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
  21. Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
  22. Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
  23. Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).

Play Video

Cite This Article
Xu, C., Ai, J., Zhang, Q., Li, T., Wu, X., Xie, Z., Duan, Z. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (133), e56515, doi:10.3791/56515 (2018).

View Video