En effektiv og enkel metode for å etablere NK og T cellelinjer fra pasienter med kronisk aktiv Epstein - Barr virusinfeksjon
Summary
En enkel metode for å få NK og T-celle kloner fra CAEBV pasienter ble utviklet med høy effektivitet, en liten mengde perifert blod og en lav dose av IL-2.
Abstract
En rekke metoder har blitt beskrevet å etablere NK/T cellelinjer fra pasienter med lymphoma eller lymphoproliferative syndrom. Disse metodene ansatt mater celler, renset NK eller T celler med så mye som 10 mL blod eller en høy dose av IL-2. Denne studien presenterer en ny metode med en kraftig og enkel å etablere NK og T-celle linjer av dyrking tilleggsutstyret blod mononukleære celler (PBMC) med tillegg av rekombinant menneskelige IL-2 (rhIL-2), og bruker så lite som 2 mL fullblod. Cellene kan spre seg raskt i to uker og opprettholdes i mer enn 3 måneder. Med denne metoden ble 7 NK eller T celle linjer opprettet med en høy suksessrate. Denne metoden er enkel, pålitelig og relevant å etablere linjer fra flere tilfeller av CAEBV eller NK/T celle lymfom.
Introduction
Epstein – Barr virus (EBV) er allestedsnærværende og infiserer ikke bare B celler, men også T og naturlig killer (NK) celler, som forårsaker en rekke EBV-assosiert NK/T lymphoproliferative sykdommer (LPD) og lymfom/leukemi, som EBV-assosiert hemophagocytic lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme-lignende lymfom, extranodal NK/T-celle lymfom, nasal type og aggressiv NK celle leukemi1,2,3. Blant disse er alvorlige kroniske aktive EBV (SCAEBV) sykdom, som er hendelsen i Sørøst-Asia, og som er nå regnet som en LPD skyldes klonal ekspansjon EBV-infiserte T eller NK celler4,5,6, 7, men uten den tilsynelatende immunsvikt presentere i mononukleose (IM)-som symptomer som feber, hepatosplenomegaly, lymfadenopati og leveren dysfunksjon vedvarende eller recurrently, i tillegg til høy EBV-DNA laste den perifert blod8,9. Pasienter med CAEBV har en dårlig prognose10,11og sin patogenese og rollen til EBV er uklart. Derfor cellelinjer avledet fra EBV-assosiert NK/T lymphoproliferative sykdommer og lymfomer er svært nyttig som cellen modeller for avklare mekanismen av EBV indusert NK eller T celle spredning og sitt forhold med høy forekomst av leukemi eller lymfom.
Hittil har ble flere linjer opprettet med ulike teknikker,12,,13,,14,,15,,16. En menneskelig NK cellen linje, NK-YS, ble etablert av NK celle lymfom/leukemi, av co dyrking med en musen stromal cell linje som mater, og i nærvær av rhIL-2 på en konsentrasjon av 20U per mL15. KAI3 var en annen NK cellen linje opprettet fra pasienter med en alvorlige mygg allergi eller SCAEBV med autologous lymphoblastoid celle linje (LCL), B-celler forvandlet ved EBV, som mater celler og tillegg av rhIL-2 på 100U/mL16. SNK6 og SNT8 var avledet fra tumor vev av nese NK/T celle lymfom pasienter ved å legge høydose rhIL-2 (700U/mL)12. Med lignende teknikk var SNK-1 cellen fra CAEBV pasienter, kultivert fra PBMC ved å fjerne T celler og legge til 700U/mL av rhIL-213,17. SNT13 og SNT15 ble etablert ved å fjerne CD4 + og CD8 + celler18. Så langt, ble andre T-celler og NK linjer fra EBV-NK/T LPD pasienter alle utviklet med denne metoden19.
Ulempene av eksisterende metoder nevnt ovenfor inkluderer ansettelse av materen celler, kravet til en høy dose av IL-2, utnyttelsen av så mye som 10 mL fullblod eller rensing av NK/T celler, som er svært utfordrende i klinikken grunn nødvendigheten av å kontrollere hvilke typer celle som EBV latently infiserer før du begynner å kultur. CAEBV forekommer hovedsakelig i barn i Asia, er 10 mL blod ikke lett å skaffe seg i alle regioner. I denne studien utviklet vi en ny enkel metode med høy suksessrate å etablere NK og/eller T celle linjer ved dyrking PBMC fra CAEBV pasienter med en lav dose av rhIL2 og en mengde 2 mL fullblod uten mater celler. Resultatene av denne metoden har vist sin høye effektivitet og tidsbesparende.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen, har en ny teknikk for å etablere NK/T cellelinjer fra fullblod CAEBV pasienter blitt utviklet. Sammenlignet med de eksisterende metodene, er Hovedfordelen med denne metoden dens enkelhet og sitt krav av bare en liten mengde blod, mens det høy suksessrate og gode forhold av cellen levedyktighet. Videre kan NK/T linjer etableres ved dyrking PBMC uten å bestemme celletyper EBV latently infiserte på forhånd, som bestemmelse ville forbruke mer blod og tid før dyrking. Alternativt cellelinjer kan analy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet ved nøkkel prosjekter av kinesiske Academy of Sciences (KFZD-SW-205), strategiske biologiske ressurser teknologi støtte systemet av kinesiske vitenskapsakademi (CZBZX-1 og ZSSB-004) og tilskudd fra National Science Foundation i Kina ( 81401640) og Shanghai naturvitenskap Fund (14ZR1434800).
Materials
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
References
- Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
- Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
- Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
- Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
- Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency?. Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
- Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
- Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
- Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
- Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
- Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
- Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
- Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
- Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
- Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
- Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
- Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
- Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
- Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
- Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
- Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
- Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
- Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
- Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).
