Summary

Эффективной и простой метод для установления линии Т-клеток у больных с хроническим активный вирус Эпштейна - Барр инфекции и НК

Published: March 30, 2018
doi:

Summary

С высокой эффективностью, небольшое количество периферической крови и низкодозированные Ил-2 был разработан простой метод для получения клоны Т-клеток и NK CAEBV больных.

Abstract

Ряд методов были описаны установить НК/T клеточных линий от пациентов с лимфомой или лимфопролиферативных синдромом. Эти методы подачи клетки, очищенный НК или T клетки как 10 мл крови или высок дозы Ил-2. Это исследование представляет новый метод с мощной и простой стратегии учредить Т-клеток и NK линии путем культивирования периферической крови мононуклеаров (КСДОР) с добавлением рекомбинантный человеческий Ил-2 (rhIL-2) и использует как маленькое как 2 мл цельной крови. Клетки могут размножаться быстро в две недели и поддерживаться более 3 месяцев. С помощью этого метода были созданы 7 НК или Т-клеток линии с высокий уровень успеха. Этот метод является простым, надежным и применимым к созданию линии клетки от больше случаев CAEBV или НК/Т-клеточной лимфомы.

Introduction

Вирус Эпштейна – Барр (EBV) повсеместно и заражает не только B-клетки, но также T и природных убийца (НК) клетки, что приводит ряд связанных EBV НК/T лимфопролиферативных заболеваний (LPD) и лимфома/лейкоз, например EBV-связанные гемофагоцитный лимфогистиоцитоз, hydroa vacciniforme как лимфома, экстранодальных НК/Т-клеточной лимфомы, носовой тип и агрессивным NK клеток лейкемии1,2,3. Среди них заболевание тяжелой хронической активных EBV (SCAEBV), который является инцидент, главным образом в Восточной Азии, и которая теперь считается LPD, вызванные клоновых расширения EBV-инфицированных T или NK клеток4,5,6, 7, но без очевидной иммунодефицита присутствует в инфекционный мононуклеоз (IM)-как симптомы, включая лихорадку, гепатоспленомегалия, лимфаденопатия и дисфункции печени постоянно или периодически, а также высокой EBV-ДНК загрузки в периферической крови8,9. У пациентов с CAEBV плохой прогноз10,11и его патогенез и роль EBV является неясным. Таким образом, мобильных линий, полученных от связанных EBV НК/T лимфопролиферативных заболеваний и лимфом очень полезны как ячейки модели для разъяснения механизма EBV индуцированной НК или Т-клеток распространения и его отношения с высоким уровнем заболеваемости лейкемией или лимфомы.

На сегодняшний день, были созданы несколько клеточных линий с различными методами12,13,14,,1516. Человеческой линии клеток НК, НК-YS, был создан от НК лимфома/лейкоз, совместного культивирования с линией стромальные клетки мыши как фидер и в присутствии rhIL-2 в концентрации 20U за15мл. KAI3 был другой NK клеток линии от больных с тяжелой комаров аллергии или SCAEBV с аутологичной лимфобластоидных клеток линии (LCL), клетки B, преобразованная EBV, как клетки фидера и добавление rhIL-216100У/мл. SNK6 и SNT8 были получены от опухоли тканей носа НК/T клеток больных лимфомами, добавив высок дозы rhIL-2 (700U/мл)12. С подобную технику SNK-1 клетка был от CAEBV больных, культивированный от КСДОР, удалив Т-клеток и добавив 700U/мл rhIL-213,17. SNT13 и SNT15 были созданы путем удаления CD4 + и CD8 + клетки18. Пока другие Т-клеток и NK клеточных линий от EBV-НК/T LPD пациентов были разработаны с этот метод19.

Недостатки существующих методов, упомянутых выше включают занятости клетки фидера, требование высок дозы IL-2, использования как 10 мл цельной крови или очистки НК/Т-клеток, что является весьма сложной в клинике из-за необходимость проверки, какие типы мобильных что EBV латентно заражает перед началом к культуре. Как CAEBV в основном происходит в детей в Азии, 10 мл крови не является легко приобрести во всех регионах. В этом исследовании мы разработали новый простой метод с высокий уровень успеха установить НК и/или Т-клеток линии путем культивирования КСДОР от CAEBV больных с использованием низких доз rhIL2 и объемом 2 мл цельной крови без клетки фидера. Результаты этого метода доказали свою высокую эффективность и экономия времени.

Protocol

Это исследование был одобрен Комитетом по этике Института генетики и биологии развития, Китайская академия наук, и протокол следует институциональных руководящих принципов для благополучия человека. Примечание: На рисунке 1 приведена схема рабочего про…

Representative Results

После 3 дней культуры во время создания клеточных линий, полиморфные клетки начинают появляться (рис. 2). После 7 дней клетки растут быстро, увеличением числа и жизнеспособность клеток на высокой скорости (рис. 3). После 10-14 дней, растет, ког?…

Discussion

В этом протоколе был разработан Роман технику для создания НК/T клеточных линий из цельной крови больных CAEBV. По сравнению с существующими методами, основным преимуществом данного метода является его простота и его требование лишь небольшого количества крови, в то время как оно exhibits выс…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана ключ проектов Китайской академии наук (KFZD-SW-205), стратегические биологических ресурсов технологии системы поддержки Китайской академии наук (CZBZX-1 и ZSSB-004) и субсидии от национального фонда науки Китая ( 81401640) и Шанхае фонда естественных наук (14ZR1434800).

Materials

Hu HLA-DR FITC BD 560944 antibody for FACS
Hu CD4 FITC BD 555346 antibody for FACS
Hu/NHP CD8 PE BD 557086 antibody for FACS
Hu CD3 PE BD 555340 antibody for FACS
Hu CD16 FITC 3G8 BD 555406 antibody for FACS
Hu/NHP CD56 PE MY31 BD 556647 antibody for FACS
hu/CD19 PE-Cy7 BD 560728 antibody for FACS
human IL-2 Roche 11147528001
human serum MRC CCC118-125
CO2 incubator SANYO
Centrifuge Techcomp CT6T Centrifugation
microscope OLYMPUS CKX53 CKX53
Automated Cell Counter Countstar IC 1000 For cell counting
24 well cell culture cluster Corning Incorporated 3524 Polystyrene plates
25cm2 cell culture flask Nest 707001 Polystyrene
FBS Gibco 10270 Component of cell medium
RPMI Medium 1640 life 22400089 For cell medium
L-Glutamine Amresco 374 Component of cell medium
100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 BioRoYee BRY-2309 Component of cell medium
Ficoll paque plus GE Healthcare 17-1440-03 For in vitro isolation of lymphocyte
DMSO Sigma D2650 For freezing cells
flow cytometer BD BD FACSAria II
soft ware BD BD FACSDiva soft ware FACS analysis

References

  1. Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
  2. Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
  3. Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
  4. Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
  5. Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency?. Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
  6. Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
  7. Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
  8. Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
  9. Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
  10. Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
  11. Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
  12. Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
  13. Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
  14. Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
  15. Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
  16. Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
  17. Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
  18. Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
  19. Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
  20. Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
  21. Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
  22. Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
  23. Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).

Play Video

Cite This Article
Xu, C., Ai, J., Zhang, Q., Li, T., Wu, X., Xie, Z., Duan, Z. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (133), e56515, doi:10.3791/56515 (2018).

View Video