Un método eficiente y Simple para establecer líneas de células T de pacientes con infección crónica activa Virus Epstein - Barr y NK
Summary
Un método simple para la obtención de clones de células T y NK de pacientes CAEBV fue desarrollado con eficacia alta, una pequeña cantidad de sangre periférica y una baja dosis de IL-2.
Abstract
Un número de métodos se ha descrito para establecer líneas de células NK/T de pacientes con linfoma o linfoproliferativo síndrome. Estos métodos emplean células de alimentador, células NK o T purificadas con tanto como 10 mL de sangre o una dosis alta de IL-2. Este estudio presenta un nuevo método con una estrategia potente y simple para establecer líneas de células T y NK por cultivo periférico de la sangre las células mononucleares (PBMC) con la adición de IL-2 humana recombinante (rhIL-2) y utiliza tan poco como 2 mL de sangre entera. Las células pueden proliferar rápidamente en dos semanas y se mantuvo por más de 3 meses. Con este método, se han establecido 7 líneas NK o células T con una alta tasa de éxito. Este método es simple, confiable y aplicable para el establecimiento de líneas celulares de más casos de linfoma CAEBV o NK/T.
Introduction
Virus de Epstein – Barr (EBV) es ubicuo y se infecta no sólo las células de B, pero también T y células naturales del asesinas (NK), que causa un número de enfermedades linfoproliferativas NK/T EBV-asociado (LPD) y linfoma, leucemia, como hemophagocytic EBV-asociado lymphohistiocytosis, Hidroa vacciniforme-como el linfoma, el linfoma de células NK/T extranodal, tipo nasal y NK agresiva de la célula leucemia1,2,3. Entre éstos es severa active EBV (SCAEBV) enfermedad crónica, que es incidente principalmente en Asia oriental, y que ahora se considera un LPD causada por la expansión clonal de EBV-infectadas T o NK células4,5,6, 7, pero sin la aparente inmunodeficiencia presentes en mononucleosis infecciosa (IM)-como síntomas incluyendo fiebre, hepatoesplenomegalia, linfadenopatía y disfunción del hígado persistente o recurrente, así como alta DNA del VEB de la carga en el sangre periférica de8,9. Los pacientes con CAEBV tienen un pronóstico pobre10,11y su patogénesis y desconoce el papel de la EBV. Por lo tanto, la célula líneas derivadas de las enfermedades lymphoproliferative EBV-asociado NK/T y los linfomas son muy útiles como modelos celulares para clarificar el mecanismo de la EBV indujo proliferación NK o células T y su relación con alta incidencia de leucemia o linfoma.
Hasta la fecha, se han establecido varias líneas celulares con diferentes técnicas12,13,14,15,16. Una línea humana de la célula NK, NK-YS, fue establecida de leucemia/linfoma de células NK, por co-cultivo con una línea de células estromales de ratón como alimentador y en presencia de rhIL-2 en una concentración de 20U por mL15. KAI3 fue otra línea de células NK establecido de pacientes con alergia severa de mosquito o SCAEBV con línea de células limfoblastoides autólogas (LCL), células B transformadas por EBV, como células de alimentador y adición de rhIL-2 100U/mL16. SNK6 y SNT8 se derivan de los tejidos tumorales de pacientes de linfoma de la célula NK/T nasales mediante la adición de altas dosis de rhIL-2 (700U/mL)12. Con técnica similar, la célula de SNK-1 era de pacientes CAEBV, cultivados de PBMC quitando las células de T y adición de 700U/mL de rhIL-213,17. SNT13 y SNT15 fueron establecidos mediante la eliminación de CD4 + y CD8 + células18. Hasta ahora, otras líneas celulares de células T y NK de pacientes LPD EBV-NK/T fueron todos desarrollados con este método19.
Las desventajas de los métodos existentes antes mencionados incluyen el empleo de células de alimentador, el requisito de una alta dosis de IL-2, la utilización de tanto como 10 mL de sangre entera o la purificación de las células NK/T, que es muy difícil en la clínica debido a la necesidad de verificar que tipos de celular latente EBV infecta antes de empezar a la cultura. Como CAEBV ocurre principalmente en niños en Asia, 10 mL de sangre no es fácil de adquirir en todas las regiones. En este estudio, hemos desarrollado un nuevo método simple con un alto índice de éxito para establecer líneas NK y célula de T por cultivo PBMC de pacientes CAEBV usando una dosis baja de rhIL2 y un volumen de 2 mL de sangre sin células de alimentador. Los resultados de este método han demostrado su alta eficiencia y ahorro de tiempo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, se ha desarrollado una nueva técnica para el establecimiento de líneas de células NK/T de la sangre de los pacientes CAEBV. En comparación con los métodos existentes, la gran ventaja de este método es su simplicidad y su exigencia de sólo un pequeño volumen de sangre, mientras que exhibe un alto índice de éxito y buenas condiciones de la viabilidad celular. Además, las líneas de la célula NK/T pueden establecerse mediante cultivo PBMC sin determinar los tipos de células EBV latente infect…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los proyectos clave de la Academia China de Ciencias (KFZD-SW-205), estratégica biológica recursos tecnología sistema de apoyo de la Academia China de Ciencias (CZBZX-1 y ZSSB-004) y por donaciones de la Fundación Nacional de Ciencias de China ( 81401640) y fondo de Ciencias naturales (14ZR1434800) de Shanghai.
Materials
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
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