En effektiv och enkel metod för att fastställa NK och T cellinjer från patienter med kronisk aktiv Epstein - Barr virusinfektion
Summary
En enkel metod för att erhålla NK och T-cell kloner från CAEBV patienter utvecklades med hög verkningsgrad, en liten mängd av perifert blod och en låg dos av IL-2.
Abstract
Ett antal metoder har beskrivits att upprätta NK/T cellinjer från patienter med lymfom eller lymfoproliferativa syndrom. Dessa metoder anställd feeder cellerna, renat NK eller T med så mycket som 10 mL blod, eller en hög dos av IL-2. Denna studie presenterar en ny metod med en kraftfull och enkel strategi att etablera NK och T-cell linjer av odlingsskålar perifera mononukleära blodkroppar (PBMC) med tillägg av rekombinant humant IL-2 (rhIL-2), och använder så lite som 2 mL helblod. Cellerna kan föröka sig snabbt i två veckor och upprätthållas för mer än 3 månader. Med den här metoden har 7 NK eller T cell linjer fastställts med en hög framgång. Denna metod är enkel, tillförlitlig och för att upprätta cellinjer från fler fall av CAEBV eller NK/T-cellslymfom.
Introduction
Epstein – Barr virus (EBV) är allestädes närvarande och infekterar inte bara B-celler, men också T och naturliga killer (NK) celler, som orsakar ett antal EBV-associerade NK/T lymfoproliferativa sjukdomar (LPD) och lymfom/leukemi, såsom EBV-associerade hemofagocyterande Lymfohistiocytos, hydroa vacciniforme-liknande lymfom, extranodal NK/T-cellslymfom, nasal typ och aggressiva NK cell leukemi1,2,3. Bland dessa är svår kronisk aktiv EBV (SCAEBV) sjukdom, som är incident främst i östra Asien, och som anses nu vara en LPD orsakas av klonal expansion av EBV-infekterade T eller NK celler4,5,6, 7, men utan den skenbara immunbrist presentera i infektiös mononukleos (IM)-som symptom som feber, hepatosplenomegali, lymfadenopati och leverdysfunktion ihållande eller återkommande, samt hög EBV-DNA lasta i den perifert blod8,9. Patienter med CAEBV har en dålig prognos10,11, och dess patogenes och rollen av EBV är oklart. Därför cellinjer som härstammar från EBV-associerade NK/T lymfoproliferativa sjukdomar och lymfom är mycket hjälpsamma som cellmodeller för att klargöra mekanismen av EBV inducerad NK eller T cell spridning och dess förhållande med hög förekomst av leukemi eller lymfom.
Hittills har flera cellinjer fastställts med olika tekniker12,13,14,15,16. En human cellinje NK, NK-YS, etablerade från NK cell lymfom/leukemi, samtidig odling med en mus stromal cellinje som mataren, och i närvaro av rhIL-2 med en koncentration på 20U per mL15. KAI3 var en annan NK cell linje etablerade från patienter med svår mygga allergi eller SCAEBV med autolog lymfoblastoida cellinje (LCL), B-celler omvandlas av EBV, som mataren cellerna och tillsats av rhIL-2 100U/mL16. SNK6 och SNT8 härleddes från tumörvävnad nasal NK/T cell lymfom patienter genom att lägga till hög dos av rhIL-2 (700U/mL)12. Med liknande teknik var SNK-1 cellen från CAEBV patienter, odlade från PBMC genom att ta bort T-celler och lägga till 700U/mL av rhIL-213,17. SNT13 och SNT15 fastställdes genom att ta bort CD4 + och CD8 + celler18. Hittills, har andra T-celler och NK cellinjer från EBV-NK/T LPD patienter alla utvecklats med denna metod19.
Nackdelarna med de befintliga metoder som nämnts ovan inkluderar anställningen av mataren celler, kravet på en hög dos IL-2, utilizationen av så mycket som 10 mL helblod eller rening av NK/T-celler, som är mycket utmanande i kliniken på grund nödvändigheten av att kontrollera vilka typer av cell att EBV latent infekterar före början till kultur. Som CAEBV förekommer främst hos barn i Asien, är 10 mL blod inte lätt att förvärva i alla regioner. I denna studie har vi utvecklat en ny enkel metod med en hög framgång att upprätta NK eller T cell linjer genom att odla PBMC från CAEBV patienter med en låg dos av rhIL2 och en volym på 2 mL helblod utan matare celler. Resultaten av denna metod har visat sin höga effektivitet och sparar tid.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll, har ny teknik för att fastställa NK/T cellinjer från helblod av CAEBV patienter utvecklats. Jämfört med de befintliga metoderna, är den stora fördelen med denna metod dess enkelhet och dess krav på endast en liten mängd blod, medan den uppvisar en hög framgång och bra villkor för cellernas viabilitet. NK/T cellinjer kan dessutom fastställas av odlingsskålar PBMC utan att fastställa celltyper de EBV latent infekterade i förväg, som bestämning skulle konsumera mer blod och tid före odl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete fick stöd av nyckel projekt av kinesiska Academy of Sciences (KFZD-SW-205), strategiska biologiska resurser teknik Support System av kinesiska vetenskapsakademin (CZBZX-1 och ZSSB-004), och genom bidrag från National Science Foundation Kina ( 81401640) och Shanghai naturvetenskap fond (14ZR1434800).
Materials
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
References
- Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
- Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
- Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
- Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
- Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency?. Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
- Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
- Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
- Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
- Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
- Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
- Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
- Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
- Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
- Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
- Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
- Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
- Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
- Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
- Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
- Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
- Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
- Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
- Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).
