NK과 만성 활성 엡 스타인-바 바이러스 감염을 가진 환자에서 T 셀 라인을 설정 하는 효율적이 고 간단한 방법

Summary

높은 효율, 적은 양의 주변 혈액 그리고 일리노이-2의 낮은 복용량 CAEBV 환자에서 NK, T 세포 클론을 얻기 위한 간단한 방법을 개발 되었다.

Abstract

다양 한 방법 설명 림프 종 또는 lymphoproliferative 증후군 환자에서 NK/T 세포 라인을 설립 되었습니다. 이러한 방법을 피더 셀, 순화 NK / T 세포, 혈액 10 mL로 또는 일리노이-2 높은 복용량 사용. 이 연구는 재조합 인간 일리노이-2 (rhIL-2)의 추가 함께 주변을 경작 하 여 NK, T 세포 라인 혈액 단 세포 (PBMC)를 설정 하는 강력 하 고 간단한 전략으로 새로운 메서드를 제공 하 고 전체 혈액의 2 mL 만큼 약간 사용 합니다. 셀 2 주에 신속 하 게 증식 수 고 3 개월 이상 유지 됩니다. 이 방법으로 7 NK 또는 T 세포 라인 높은 성공율으로 설립 되었습니다. 이 메서드는 간단 하 고 신뢰할 수 있는, 더 많은 경우의 CAEBV 또는 NK/T 세포 림프 종에서 셀 라인 구축에 적용.

Introduction

엡 스타인-바 바이러스 (EBV) 유비 쿼터 스 이며 감염 B 셀 뿐만 아니라 T 및 자연적인 살인자 (NK) 세포 EBV 관련 된 NK/T lymphoproliferative 질병 (LPD) 및 림프 종/백혈병, EBV 관련 hemophagocytic 등의 수는 lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme와 같은 림프 종, extranodal NK/T-세포 림프 종, 비 강 유형 및 호전적인 NK 세포 백혈병^1,2,3. 이러한 가운데는 심각한 만성 활성 EBV (SCAEBV) 질병, 사고, 동남 아시아에서 주로 그리고 있는 지금 LPD EBV 감염 T 나 NK 세포^4,,56, 의 클론 확장으로 인 한 것으로 간주 됩니다. ⁷, 하지만 명백한 면역 결핍 없이 전염 성 mononucleosis (IM)에 존재-처럼 높은 EBV DNA로 서 지속적으로 또는 recurrently, 발열, hepatosplenomegaly, lymphadenopathy, 및 간 기능 장애 등 증상에 로드는 말 초 혈액^8,9. CAEBV 가진 환자는 빈약한 예 지^10,11및 그것의 병 인 그리고는 EBV의 역할은 분명 하다. 따라서, EBV 관련 된 NK/T lymphoproliferative 질병에서 파생 된 라인 세포 및 림프 종 백혈병의 발생률이 높은와 NK 또는 T 세포 확산 및 그것의 관계를 유도 EBV의 메커니즘을 명확히 셀 모델로 매우 도움이 또는 림프 종입니다.

날짜 하려면, 여러 셀 라인 다른 기법^{12,13,14,,1516}함께 설립 되었습니다. 인간 NK 세포 선, NK-YS, NK 세포 림프 종/백혈병, 피더로 그리고 rhIL-2 mL¹⁵당 20U의 농도에서 존재 마우스 stromal 세포 라인 공동 경작에 의해 설립 되었다. KAI3 다른 NK 세포 선 심각한 모기 알레르기를 가진 환자 또는 헌 lymphoblastoid 셀 라인 (LCL), SCAEBV에서 설립 되었다 B 세포 EBV, 피더 세포와 100U/mL¹⁶rhIL-2의 추가 변형. SNK6와 SNT8는 rhIL-2 (700U/mL)¹²의 높은 복용량을 추가 하 여 비 강 NK/T 세포 림프 종 환자 들의 종양 조직에서 파생 되었다. 유사한 기술, SNK-1 셀 CAEBV 환자, PBMC에서 T 세포를 제거 하 고 rhIL-2^13,17700U/mL을 추가 하 여 양식에서 했다. SNT13와 SNT15는 CD4 + 및 CD8 + 세포¹⁸제거 하 여 설립 되었다. 지금까지, EBV-NK/T LPD 환자에서 다른 T 세포와 NK 세포 선이 방법¹⁹모두 개발 되었다.

위에서 언급 한 기존 방법의 단점 때문에 병원에서 매우 도전적인는 일리노이-2로 10 mL 전 혈의 활용 또는 NK/T 세포의 정화의 높은 복용량의 요구 피더 세포의 고용 포함 어떤 종류의 세포는 EBV latently 확인의 필요성 문화 시작 하기 전에 감염. CAEBV 아시아 아이 들에서 주로 발생 10 mL 혈액 모든 지역에서 얻기 쉽지 않다. 이 연구에서 우리는 피더 세포 없이 rhIL2의 낮은 복용량과 전체 혈액의 2 mL의 볼륨을 사용 하 여 CAEBV 환자에서 PBMC를 경작 NK / T 세포 라인을 구축 하 고 성공률을 새로운 간단한 방법을 개발. 이 방법의 결과 그것의 높은 효율성과 시간 절약을 입증 했다.

Protocol

이 연구는 연구소의 유전학 그리고 개발 생물학, 과학의 중국 아카데미의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 그리고 프로토콜 인간의 복지에 대 한 제도적 지침을 따릅니다. 참고: 워크플로 회로도 대 한 그림 1 을 참조 하십시오. 1입니다. CAEBV 환자에서 PBMC의 격리 그라데이션 (예를 들어, Ficoll-패)에 의해 CAEBV 환자의 전?…

Representative Results

후에 3 일 셀 라인의 설립 동안 문화, 다형성 세포 나타납니다 (그림 2)를 시작 합니다. 7 일 후 세포 수와 세포의 생존 능력 (그림 3) 높은 속도로 증가 신속 하 게, 성장. 셀의 작은 클러스터 셀 농도 3-6 × 106을 초과할 수 있습니다 때, 성장 하는 10-14 일 후 명확 하 게 볼 수 있습니다. 이 기간에 문화 접시 2 개 또는 3 개의 ?…

Discussion

이 프로토콜에서 CAEBV 환자의 전체 혈액에서 NK/T 세포 라인을 설립 하는 새로운 기술 개발 되었습니다. 기존의 방법에 비해,이 방법의 주요 장점은 그것의 단순 하 고 작은 양의 혈액의 그것의 필요 조건 그것은 세포 생존 능력의 좋은 조건과 높은 성공률을 전시 하는 동안. 게다가, NK/T 세포 라인 셀 형식 결정으로 사전에 감염 latently EBV 소비 더 많은 혈액과 경작 하기 전에 시간을 확인 하지 않고 PB…

Materials

Hu HLA-DR FITC	BD	560944	antibody for FACS
Hu CD4 FITC	BD	555346	antibody for FACS
Hu/NHP CD8 PE	BD	557086	antibody for FACS
Hu CD3 PE	BD	555340	antibody for FACS
Hu CD16 FITC 3G8	BD	555406	antibody for FACS
Hu/NHP CD56 PE MY31	BD	556647	antibody for FACS
hu/CD19 PE-Cy7	BD	560728	antibody for FACS
human IL-2	Roche	11147528001
human serum	MRC	CCC118-125
CO2 incubator	SANYO
Centrifuge	Techcomp	CT6T	Centrifugation
microscope	OLYMPUS CKX53	CKX53
Automated Cell Counter	Countstar	IC 1000	For cell counting
24 well cell culture cluster	Corning Incorporated	3524	Polystyrene plates
25cm2 cell culture flask	Nest	707001	Polystyrene
FBS	Gibco	10270	Component of cell medium
RPMI Medium 1640	life	22400089	For cell medium
L-Glutamine	Amresco	374	Component of cell medium
100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309	BioRoYee	BRY-2309	Component of cell medium
Ficoll paque plus	GE Healthcare	17-1440-03	For in vitro isolation of lymphocyte
DMSO	Sigma	D2650	For freezing cells
flow cytometer	BD	BD FACSAria II
soft ware	BD	BD FACSDiva soft ware	FACS analysis