Summary

Doymuş yağ asitleri Ceramide ilişkili makrofaj hücre ölümüne neden

Published: October 31, 2017
doi:

Summary

Kemik iliği hücrelerinden fare birincil makrofajlar türetmek için bir düz ileri yöntem göstermek ve BSA-yağ asidi hazırlamak için basit bir yöntem conjugates. Sonra doymuş yağ asitleri makrofaj hücre ölümüne neden olabilir ve bu tür hücre ölümü olumlu ceramide düzeyleri hücresel birikimi ile ilişkilidir gösterir.

Abstract

Makrofajlar epidermal yağ asidi bağlayıcı protein ve yağ yağ asidi bağlayıcı protein son derece hızlı. Onlar aktif alımı doymuş ve doymamış yağ asitleri, bağışıklık fonksiyonları düzenlenmesinde önemli bir rol oynayabilir. Çok sayıda çalışmalar çeşitli yağ asitleri, doymuş olduğunu göstermiştir veya doymamış, Mayıs hücre büyümesi ve fonksiyonu farklı etkileri sahip. Ancak, yağ asidi hazırlık için kullanılan yaklaşımlar değişir, hangi fizyolojik olmayan sonuçlara neden olabilir. Serum albümin, memeli periferik kan, yağ asitleri için doğal bir taşıyıcı yağ asitlerinin sodyum tuzu ile karmaşık eşlenik şekillendirme için yağ asidi işlevinde böylece yağ asidi sabun toksisite en aza indirerek memeli hücreleri, eğitim için önerilir. Bu nedenle, basit, nispeten hızlı Isıtma ve yöntem sonicating geliştirilen ve burada BSA-yağ asit eşlenik oluşumu için sunulan. Doymuş yağ asitleri, özellikle Stearik asitler şiddetli hücre ölümü fare kemik iliği türetilmiş makrofajlar içinde ikna etmek için bir iletişim kuralı’nı açıklar. Biz daha fazla doymuş yağ asidi indüklenen hücre ölümü olumlu birikmiş hücresel ceramide düzeyleri ile ilişkili olduğunu gösterir. Bu yöntem yağ asidi diğer memeli hücreleri üzerinde etkisini çalışmaları için genişletilebilir.

Introduction

Yağ asitleri enerji metabolizması ve farklı hücre membran fosfolipitler sentezi kritik bir rol oynamaktadır. Yağ asitleri sulu düşük bir çözünürlük var. Yağ asidi uygun hazırlanması biyolojik fonksiyonları memeli hücrelerinde yağ asitlerinin çalışmak için kritik önem taşıyor. Yağ asitleri etanol ile hazırlanır birçok yağ asitleri bile nispeten düşük konsantrasyonlarda1hücre zarının toksik sabun (deterjan) etkileri göstermek. Bir doğal, büyük taşıyıcı serum serbest yağ asitleri için serum albümin yağ asidi teslim vitro yağ asidi işlevi deneyleri için2,3,4için iyi bir taşıyıcı olarak kabul edilir. Birçok araştırma kağıtları yağ asitleri kullanarak yayımlanmış olsa bile ancak, yağ asidi ve serum albümin eşlenik hazırlanması ayrıntılarını genellikle kullanılabilir değil.

Makrofajlar epidermal yağ asidi bağlayıcı protein ve yağ yağ asidi bağlayıcı protein5,6,7,8son derece hızlı. Onlar aktif alımı doymuş ve doymamış yağ asitleri bağışıklık işlevleri düzenleyen. Makrofajlar ve diğer hücrelerin yağ asitlerinin etkisi çalışma için uygulanan1,7,9yağ asidi hazırlık farklı yöntemleri vardı. Yağ asitleri makrofaj fonksiyonları üzerine etkisini araştırmak için uygun şekilde hazırlanmış yağ asidi/serum albümin conjugates kullanarak biyolojik anlamlı veri almak üzere kritik önem taşımaktadır. Yağ asitleri makrofaj fonksiyonları üzerine etkisi üzerinde çalışmalar temel bilgi ve yağ asidi metabolizmasının hastalıklarda makrofaj söz konusu ile ilgili potansiyel tedavi hedefleri sağlar.

Protocol

protokol kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Louisville Üniversitesi tarafından kabul edildi. 1. fare kemik iliği türetilmiş makrofajlar (BMDMs) Euthanize CO 2 kullanarak bir 6 – için 8-hafta-yaşlı, sağlıklı vahşi tip fare. Bir köpük tahta aşağı pin ve sırılsıklam olana % 70 etanol ile sprey. Tibia/uyluk kemikleri forseps ve makas ile kaldırın. Onları 5 mL 1 x fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile petri kabına koyardım. Ster…

Representative Results

Obezite Serumda serbest yağ asitleri konsantrasyonları artar. Profesyonel fagositler makrofajlar aktif olarak ana bilgisayar homeostazı korumak için yağ asitleri götür. Bu işlemler sırasında aşırı yüklenmiş lipidler makrofaj hücre ölümüne neden olabilir. Bu amaçla, biz BMDMs vitro obez düzeyde diyet yağ asitleri ve akış sitometrik boyama kullanarak ölçülen makrofaj hücre ölümü ile kültürlü. Doymuş yağ asitleri, BSA denetimine göre özellikle S…

Discussion

Yağ asidi çözüm uygun hazırlanması yağ asitlerinin biyolojik işlev eğitim için kritik öneme sahiptir. Yağ asidi nötralize sulu çözüm onun çözünürlük artar. Ancak, hala su veya PBS düşük çözünürlük, yağ asitlerinin, özellikle doymuş yağ asitleri, sodyum tuzları şunlardır biz gözlenen. Bir yöntem yağ asidi1dağıtılması yardımcı olmak için % 95-100 etanol kullanmaktır. Bu yöntemi kullanarak, hücrelere daha yüksek toksisite daha az toksik doymamış ya?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser kısmen Louisville Üniversitesi başlangıç fonlar tarafından desteklendi ve Ulusal Kanser Enstitüsü (Bethesda, MD) R01CA177679, R01CA180986 verir.

Materials

CPX Ultrasonic Bath  Bransonic Model 2800
Sodium palmitate (PA) Nu-Chek Prep, Inc. S-1109 M.W. 278
Sodium stearate (SA) Nu-Chek Prep, Inc. S-1111 M.W. 306
Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free Fisher Scientific 9048-46-8
Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF)  Cell Signaling Technology,  Inc. 5228
RPMI 1640 VWR International 71002-878
Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate Fisher Scientific A13201
7-AAD BD Biosciences 559925
Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) Sigma C8104-50TST Clone: MID 15B4
Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate Sigma AP128F
Fixation buffer Biolegend 420801
Permeabilization buffer Ebioscience 4307693
Red Blood Cell Lysis Buffer  Sigma 11814389001
Annexin V Binding Buffer BD Biosciences 556454
L929 cells ATCC CCL-1
Corning Cell Lifter  Fisher Scientific 07-200-364
Note: M.W. is for molecular weight.

References

  1. Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
  2. Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
  3. Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
  4. Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
  5. Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
  6. Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
  7. Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
  8. Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
  9. Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
  10. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
  11. Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
  12. Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).

Play Video

Cite This Article
Zhang, Y., Hao, J., Sun, Y., Li, B. Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death. J. Vis. Exp. (128), e56535, doi:10.3791/56535 (2017).

View Video