חומצות שומן רוויות לגרום מוות תאי מקרופאג Ceramide-הקשורים
Summary
אנחנו להמחיש שיטה ישר קדימה כדי להפיק מאתר ראשי מקרופאגים מתאי מח עצם, שיטה פשוטה להכנת BSA-חומצות conjugates. ואז נדגים כי חומצות שומן רוויות יכול לגרום מוות תאי מקרופאג, כגון מוות של תאים קשורה באופן חיובי הסלולר הצטברות ceramide רמות.
Abstract
מקרופאגים לבטא מאוד אפידרמיס חומצת שומן מחייב חלבון ואת אדיפוז חומצת שומן מחייב חלבון. הם באופן פעיל ספיגת רווי, חומצות שומן בלתי רוויות, אשר עשויים לשחק תפקיד קריטי בוויסות פונקציות החיסונית שלהם. מחקרים רבים הראו כי חומצות שומן שונות, רווי או במאי רוויים, בעלי השפעות שונות על צמיחת תאים ותפקוד. עם זאת, הגישות המשמש להכנת חומצת שומן משתנים, אשר עלול להוביל לתוצאות שאינן-פיזיולוגיים. אלבומין, נשאית הטבעי של חומצות שומן בדם היקפי יונקים, מומלצת ויוצרים את המספר המשלים מורכבים עם מלח הנתרן של חומצות שומן כדי לחקור פונקציה חומצת שומן בתאי יונקים, ובכך לחסוך הרעילות של חומצת שומן סבון. לפיכך, פשוט, מהיר יחסית חימום, sonicating שיטה שפותחה, המובאת כאן על היווצרות תרכיב חומצה BSA-שומן. אנו מתארים פרוטוקול באמצעות חומצות שומן רוויות, חומצות סטארית במיוחד כדי לגרום מוות תאי חמור ב העכבר מח נגזר מקרופאגים. נדגים בהמשך כי מות תאים הנוצרות על-ידי חומצות שומן רוויות קשורה באופן חיובי ceramide הסלולר שהצטברו רמות. בשיטה זו ניתן להרחיב ללימודי ההשפעה של חומצות השומן בתאי יונקים אחרים.
Introduction
חומצות שומן לשחק תפקיד חיוני לחילוף חומרים של אנרגיה, הסינתזה של קרום phospholipids סוגים שונים של תאים. חומצות שומן יש המסיסות מימית נמוכה. הכנה מתאימה של חומצות שומן יש חשיבות קריטית ללמוד על תפקודים ביולוגיים של חומצות שומן בתאי יונקים. כאשר חומצות שומן מוכנים עם אתנול, חומצות שומן רבים עשוי להראות השפעתם רעילים סבון (דטרגנטים) על קרום התא, אפילו בריכוזים נמוכים יחסית1. בתור נהג טבעי, רס ן עבור חומצות שומן בחינם בהסרום, אלבומין נחשב נשאית טוב של חומצת שומן משלוח במבחנה חומצת שומן פונקציה מבחני2,3,4. עם זאת, הפרטים של הכנת המספר המשלים חומצת שומן, אלבומין בדרך כלל אינם זמינים אף-על-פי פורסמו עבודות מחקר רבות באמצעות חומצות שומן.
מקרופאגים לבטא מאוד אפידרמיס חומצת שומן מחייב חלבון ואת אדיפוז חומצת שומן מחייב חלבון5,6,7,8. הם באופן פעיל ספיגת רווי, חומצות שומן בלתי רוויות אשר ייתכן לווסת פונקציות החיסונית שלהם. לחקור את ההשפעה של חומצות שומן על מקרופאגים ותאים אחרים, שיטות שונות של הכנת חומצות שומן היו יישומית1,7,9. באמצעות חומצת שומן מוכן כראוי/סרום אלבומין conjugates לחקור את ההשפעה של חומצות השומן על תפקוד מקרופאג יש חשיבות קריטית בקבלת נתונים משמעותיים מבחינה ביולוגית. מחקרים על ההשפעה של חומצות השומן על תפקוד מקרופאג יכול לספק ידע בסיסי פוטנציאלים טיפולית הנוגעים מטבוליזם חומצות שומן מעורב מקרופאג מחלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הכנה נכונה של חומצת שומן פתרון יש חשיבות קריטית כדי ללמוד את התפקוד הביולוגי של חומצות שומן. הניטרול של חומצת שומן מעלה מסיסות שלה ב תמיסה מימית. עם זאת, מלחי נתרן של חומצות שומן, בעיקר חומצות שומן רוויות, הן עדיין של מסיסות נמוכה במים או PBS הבחנו. שיטה אחת היא להשתמש אתנול 95-100% כדי לסייע לפזר …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה חלקית על ידי ראשונית אוניברסיטת לואיוויל ומענקים המכון הלאומי לסרטן (בת’סדה, מרילנד) R01CA177679, R01CA180986.
Materials
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Note: M.W. is for molecular weight. |
References
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
- Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
- Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
- Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
- Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
- Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
- Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
- Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
- Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
- Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).
