Mättade fettsyror inducerar Ceramide-associerade makrofag celldöd
Summary
Vi illustrerar en okomplicerad metod för att härleda murina primära makrofager från benmärgsceller och en enkel metod att förbereda BSA-fettsyra konjugat. Då visar vi att mättade fettsyror kan inducera makrofag celldöd, och sådana celldöd är positivt associerad med cellulära ackumulering av ceramid nivåerna.
Abstract
Makrofager uttrycker mycket epidermal fettsyra-bindande protein och fett fettsyra-bindande protein. De aktivt upptag mättade och omättade fettsyror, som kan spela en avgörande roll i regleringen av deras immun funktioner. Många studier har visat att olika fettsyror, mättade eller omättade, kan ha olika effekt på cellernas tillväxt och funktion. Metoder som används för fettsyra förberedelse varierar dock, vilket kan leda till icke-fysiologiskt resultat. Serumalbumin, en naturlig bärare för fettsyror i däggdjur perifert blod, rekommenderas för att bilda ett konjugat komplex med natriumsaltet av fettsyror att studera fettsyra funktion i däggdjursceller, sålunda minimizing toxiciteten av fettsyra tvål. Således, en enkel, relativt snabb uppvärmning och sonicating metod utvecklas och presenteras här för BSA-fatty acid konjugat bildandet. Vi beskriver ett protokoll med mättade fettsyror, särskilt stearinsyra syror att inducera allvarliga celldöd i mus benmärg härrör makrofager. Vi visar vidare att mättade fettsyror-inducerad celldöd är positivt associerade med ackumulerade cellulära ceramid nivåerna. Denna metod kan förlängas för studier av effekterna av fettsyra på andra däggdjursceller.
Introduction
Fettsyror spelar en avgörande roll i energiomsättningen och i syntesen av fosfolipidmembran i olika typer av celler. Fettsyror har en låg vattenlöslighet. Lämplig preparering av fettsyra är av avgörande betydelse för att studera de biologiska funktionerna av fettsyror i däggdjursceller. När fettsyror är beredda med etanol, kan många fettsyror Visa deras giftiga tvål (tvättmedel) effekt på cellmembranet, även vid relativt låga koncentrationer1. Som en naturlig, större transportör för fria fettsyror i serum anses serum albumin vara en bra bärare för fettsyra leverans i vitro för fettsyra funktion analyser2,3,4. Men är detaljerna i utarbetandet av fettsyra och serumalbumin konjugat oftast inte tillgänglig trots att många forskningsrapporter med fettsyror har publicerats.
Makrofager uttrycker mycket epidermal fettsyra-bindande protein och fett fettsyra-bindande protein5,6,7,8. De aktivt upptag mättade och omättade fettsyror som kan reglera deras immunförsvar fungerar. För att studera effekterna av fettsyror på makrofager och andra celler, var olika metoder för fettsyra beredning tillämpad1,7,9. Använda lämpligt beredda fettsyra/serum albumin konjugat för att undersöka effekterna av fettsyror på makrofag funktion är av avgörande betydelse att få biologiskt meningsfulla data. Studier om effekterna av fettsyror på makrofag funktion kan ge grundläggande kunskaper och potentiella terapeutiska mål avseende fettsyra metabolism i makrofag-inblandade sjukdomar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Korrekt beredning av fettsyra lösning är av avgörande betydelse att studera den biologiska funktionen av fettsyror. Neutralisering av fettsyra ökar dess löslighet i vattenlösning. Natriumsalter av fettsyror, särskilt mättade fettsyror, är dock fortfarande av låg löslighet i vatten eller PBS som vi observerade. En metod är att använda 95-100% etanol för att upplösa fettsyra1. Med den här metoden kan högre toxicitet för celler observeras även vid lägre koncentrationer för mindre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete var stöds delvis av University of Louisville start-up fonderna och National Cancer Institute (Bethesda, MD) beviljar R01CA177679, R01CA180986.
Materials
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Note: M.W. is for molecular weight. |
References
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
- Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
- Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
- Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
- Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
- Wen, H., et al. Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling. Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).
- Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
- Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
- Dansen, T. B., et al. High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2). Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).
- Ulloth, J. E., et al. Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death. Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).
