분 비 소포 및 Exocytosis 삼투성 스트레스의 효과 모니터링

요약

삼투성 스트레스에는이 과정을 발표 하는 신경 전달 물질의 양과 exocytosis 영향을 줍니다. 전송 전자 현미경 검사 법 함께 전기 화학 방법 결합 수 있습니다 사용 하는 방법을 exocytosis 활동, 소포 quantal 크기, 출시 하는 신경 전달 물질의 양과에 extracellular 삼투성 압력의 효과 연구 설명 동안 exocytosis.

초록

Amperometry 셀 exocytosis 활동 및 단일 exocytosis 이벤트에 소포에서 발표 하는 신경 전달 물질의 양을 줄여이 물리적 스트레스에 응답 하는 분 비 세포는 삼투성 충격 쇼 대상의 기록. 그것은 추방 하는 신경 전달 물질의 감소 그 셀 축소 삼투성 스트레스에 대응에서 하 고 그 가정으로 분 비 소포 세포 세포질에 영향을 받지 않습니다 막 생물 속성에 변경 예정 이다 제안 되었습니다. 의해 세포 외 삼투성 긴장. Amperometry 녹음 exocytosis의 어떤 순간을 소포 플라즈마 막으로 퓨즈 하지만 소포 융해 트리거되기 전에 기 내용에 정보를 제공 하지 않습니다 세포에서 출시 모니터링 합니다. 따라서, amperometry를 결합 하 여 세포 exocytosis 트리거되기 전에 분 비 소포를 특성화 할 수 있다 다른 보완 분석 방법으로 녹음 어떻게 분 비 소포 검사에 대 한 광범위 한 개요를 제공 하 고는 exocytosis 프로세스 삼투성 충격에 의해 영향을 받습니다. 우리는 여기 amperometry 세포내 전기 cytometry 및 전송 전자 현미경 (TEM) 영상 기록 보완 사용 하는 방법을에 분 비 소포 크기와 신경 전달 물질 콘텐츠 변경 하 설명 삼투성 스트레스에 노출 전후 exocytosis 활동에 관하여 chromaffin 세포. 모든 세 가지 분석 방법을 사용 하 여 실험에서 얻은 정량적 인 정보를 연결 하 여 결론 이전에 수행 된 분 비 소포 크기에서 긴축 하 고 소포 quantal 크기를 감소 하 여 세포 외 삼투성 긴장에 응답 일정 한 소포 신경 전달 물질 농도 유지 합니다. 따라서,이 왜 삼투성 스트레스에 대 한 응답에 소포 exocytosis 릴리스 동안 발표 금액 신경 전달 물질 감소에 관한 몇 가지 설명을 제공 합니다. Amperometric 녹음 여기 이것은 가역 과정과 그 기 후 배치 셀 isotonic 환경으로 되돌려 때 삼투성 충격 신경 전달 물질과 리필 됩니다 나타냅니다.

서론

아드레날린에 있는 chromaffin 세포는 혈 류로 신경 전달 물질 분자를 풀어 신경 내 분 비 세포. 이 도킹을 포함 하는 세포질 프로세스 및 신경 전달 물질 채워진 소포, exocytosis를 불리는 과정에서 세포 외 공간에 콘텐츠 자료 소포에서 결과의 융합을 통해 발생 합니다. 신경 전달 물질 (아드레날린과 더욱) chromaffin 세포에서 적극적으로 큰 밀도 코어 소포 (LDCVs)으로 막 단백질에 의해 수송 하 고 높은 농도 (~0.5-1 M)^1,2에 저장. LDCVs 내의 신경 전달 물질의 축적은 chromogranin 단백질 (~ 169 mg/mL)^{3,4,5의 구성 intravesicular 밀도 핵심 단백질을 카 테 콜 아민 분자에의 선호도 의해 수행 ,6}, 그리고 ATP (125-300 m m)⁷, 캘리포니아^{2 +} 등 기도 카 테 콜 아민 로드 및 저장을 위한 주요 구성 요소를 ....

프로토콜

1. 아드레날린에서 효소 소화에 의해 격리 소 Chromaffin 세포 세포 배양

1. 소 아드레날린에서 수집 chromaffin 세포를 격리 하려면 셀 70% 에탄올 용액으로 소독. 멀리 지방과 결합 조직 메스를 사용 하 여 정돈 하십시오. 씻어 37 ° c.에 thermostated 되었습니다 로크의 솔루션 (NaCl 154 m m, KCl 5.6 m m, NaHCO3 3.6 m m, hydroxyethyl piperazineethanesulfonic 산 (HEPES) pH 7.4에 5.6 m m)를 사용 하 여 부 신 정 맥 혈액을 제거 하려면
2. 조직, 소화 약 2.5 mL 따뜻한 살 균 필터링 0.2% 콜라 P 솔루션의 주사기를 사용 하 여 부 신 정 맥을 통해 주입 하 여 각 동맥을 팽창 시키고 37 ° c.에 20 분에 대 한 조직을 품 어 모 수의 소화 과정을 완료 수 있도록 동맥을 검사 합니다. 조직이 부드럽고 강렬 하지 느껴야 합니다.
3. 소화 모 snipping 경도 방향에 있는 땀 샘에 의해 수집 합니다. 메스를 사용 하 여 골 수 조직을 말하다. 강 체에 조직 정지를 필터링 하 고 로크의 솔루션 콜라 피 활동을 줄이기 위해 볼륨 약 50ml로 희석
4. 실 온에서 10 분 원심 분리기에서 300 x g에서 셀 펠 렛....

결과

우리 여기 어떻게 상승의 효과에 암시는 광범위 한 보기는 정보를 제공할 수 두 전기 방법론, 탄소 섬유 amperometry와 세포내 전기 cytometry 함께 가장 영상 결합 프로토콜 설명 분 비 소포 및 exocytosis 프로세스에 extracellular 삼투성 압력. 비교 실험 설정 ( 그림1에서 참조)를 사용 하 여 단일 chromaffin 세포 exocytosis 릴리스의 대표 amperometric 녹음, exocytotic 활동에 있는 뜻깊은 감소 했다 표시 셀 삼투성에 노출 됐다 isotonic 조건 셀에 비해 스트레스 (그림 2A)²⁴. 이 녹음에서와 Faraday´s 법을 사용 하 여, 총에 의해 감지 각 개별 amperometric 현재 스파이크 셀에 서로 다른 노출에서 단일 기 exocytosis 이벤트에서 추방 하는 분자의 수를 계산 하는 데 사용 되었.......

토론

우리는 여기 프로토콜과 결합 분 비 소포 및 삼투성 압력 등 물리적 힘 분 비 소포에 영향을 미칠 방법의 더 나은 이해를 얻기 위하여 exocytosis 프로세스 분석 3 보완 분석 방법의 장점을 제시합니다 그리고 분 비 세포에서 exocytosis 프로세스입니다. 이러한 방법은 exocytosis 활동, 세포내 전기 cytometry 소포 그들의 네이티브 환경에서의 quantal 크기를 결정 하는 데 사용 되는 기록에 대 한 설립 방법은 탄소 섬유 microelectrode amperometry를 포함 하 고 전송 전자 현미경 이미지 분석 분 비 소포 볼륨을 모니터링. 이 작품에는 isotonic 고 extracellular 환경에 노출 chromaffin 세포에서 단일 기 exocytosis 이벤트의 amperometry 녹음에서 양적 데이터를 수집 하 여 우리 확인 그 삼투성 충격을 현저히 감소 하는 금액 신경 전달 물질 exocytosis 동안 발표 하 고이 세포 수 역 복구 하 고 원래 수량 놓습니다 isotonic 환.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
NaCl	시그마 알드리치	S7653
KCl	시그마 알드리치	P9333
NaHCO3	시그마 알드리치	S5761
HEPES	시그마 알드리치	H3375
MgCl2	시그마 알드리치	M-2670
포도당	시그마 알드리치	G8270
Collagenase P	Roche, 스웨덴	11 213 857 001
100-&마이크로; M 나일론 메쉬	Fisher Sientific	08-771-19
Percoll	Sigma Aldrich	P1677
콜라겐 IV 코팅 60mm 플라스틱 접시	VWR	354416
원심 분리기	Avanti J-20XP
붕규산 유리 모세관	셔터 기기 Co., Novato, CA
마이크로 피펫 풀러	Narishing Inc., 일본	PE-21
에폭시 용액 (A 및 B)	에폭시 기술, Billerica, MA
Beveller	Narishing Inc.	EG-400
도립 현미경	Olympus	IX81
패치 클램프 기기	분자 장치, Sunnyvale, CA	Axopatch 200B
Micromanipulator	Burleigh Instrument Inc., USA	PCS-5000
부탄 화염	Multiflame AB, Hä sselholm, 스웨덴
투과 전자 현미경	Omega	Leo 912 AB