Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Toezicht op het Effect van de Stress van de osmotische op secretoire blaasjes en exocytose

Published: February 19, 2018 doi: 10.3791/56537
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Chemistry and Chemical Engineering, Chalmers University of Technology, 2Department of Chemistry and Molecular Biology, University of Gothenburg

Summary

Osmotische stress beïnvloedt exocytose en de hoeveelheid neurotransmitter uitgebracht tijdens dit proces. We laten zien hoe elektrochemische methoden samen met transmissie-elektronenmicroscopie combineren kan worden gebruikt voor het bestuderen van het effect van extracellulaire osmotische druk op exocytose activiteit, blaasje quantal grootte en de hoeveelheid neurotransmitter vrijgegeven tijdens exocytose.

Abstract

Amperometry opname van cellen die zijn onderworpen aan osmotische schok Toon die secretoire cellen op deze fysieke stress reageren doordat de exocytose activiteit en de hoeveelheid neurotransmitter vrijgelaten uit de blaasjes in één exocytose gebeurtenissen. Er is gesuggereerd dat de vermindering in neurotransmitters verdreven als gevolg van wijzigingen in de membraan biofysische eigenschappen is wanneer cellen in reactie op osmotische stress krimpen en met aannames gemaakt dat secretoire blaasjes in het cytoplasma van de cel ondervinden geen problemen door extracellulaire osmotische stress. Amperometry opname van exocytose controleert wat wordt vrijgelaten uit de cellen het moment een blaasje combineert met het plasma-membraan, maar levert geen informatie over de inhoud van het vesikel voordat de fusie blaasje wordt geactiveerd. Daarom biedt opname met andere aanvullende analytische methoden die kunnen karakteriseren de secretoire blaasjes voordat exocytose op cellen wordt geactiveerd door het combineren van amperometry een breder overzicht voor de behandeling van hoe secretoire blaasjes en de Exocytose proces worden beïnvloed door osmotische schok. We beschrijven hier hoe aanvulling amperometry opnemen met intracellulaire elektrochemische cytometry en Transmissie Electronenmicroscopie (TEM) beeldvorming kan worden gebruikt voor het karakteriseren van de wijzigingen in de grootte en neurotransmitter inhoud secretoire blaasjes op chromaffin cellen ten opzichte van exocytose activiteit voor en na blootstelling aan osmotische stress. Door de koppeling van de kwantitatieve gegevens die experimenten met behulp van alle drie de analytische methoden, werden conclusies eerder gemaakt dat secretoire blaasjes op extracellulaire osmotische stress reageren door inkrimping in grootte en het blaasje quantal grootte te verminderen het handhaven van een constante vesikel neurotransmitter concentratie. Vandaar, dit geeft duidelijkheid over waarom blaasjes, in reactie op osmotische stress, vermindering van de hoeveelheid neurotransmitters uitgebracht tijdens exocytose release. De amperometrische opnames hier blijkt dit een omkeerbaar proces en dat blaasje nadat osmotische schok worden nagevuld met neurotransmitters wanneer geplaatste cellen zijn teruggekeerd in een isotone milieu.

Introduction

Chromaffin cellen in de bijnieren zijn neuro-endocriene cellen die release neurotransmitter moleculen in de bloedstroom. Dit gebeurt door een cellulaire proces waarbij de docking en de fusie van de neurotransmitter gevulde blaasjes, resulterend in de release van de inhoud van blaasjes aan de extracellulaire ruimte in een proces genaamd exocytose. De neurotransmitters (adrenaline en noradrenaline) in chromaffin cellen worden actief getransporteerd door membraaneiwitten in grote dichte kern blaasjes (LDCVs) en opgeslagen bij hoge concentraties (~0.5-1 M)1,2. Accumulatie van neurotransmitters in de LDCVs wordt bereikt door de affiniteit van catecholamine moleculen naar de intravesicular dichte kern eiwit matrix bestaat uit chromogranin eiwitten (~ 169 mg/mL)3,4,5 ,6, en een intravesicular cocktail oplossing met belangrijke onderdelen voor catecholamine laden en opslag in het vesikel zoals ATP (125-300 mM)7, Ca2 + (50-100 µM in de oplossing en een ~ 40 mM gebonden aan de eiwit matrix)8Mg2 + (5 mM)9, ascorbaat (10-30 mM)10en een pH van ~5.511,12. De LDCVs handhaven een iso-osmotische voorwaarde met de cel cytoplasma (310 mOsm/kg)13, hoewel de theoretische opgeloste concentratie binnen de blaasjes optellen tot meer dan 750 mm bedraagt. De samenstelling van de intravesicular componenten is niet alleen essentieel voor het laden en opslaan van catecholamines, maar ook voor samenvoeging van opgeloste stoffen naar de dichte kern eiwit matrix. Dit vermindert het installatieprogramma de osmolariteit van de blaasjes aanzienlijk verminderd en kan invloed hebben op het bedrag catecholamine die is uitgebracht tijdens exocytose5,6.

Studies over het effect van extracellulaire osmotische druk op het proces van exocytose door amperometrische opname hebben gemeld dat hoge extracellulaire osmotische druk remt exocytose activiteit en vermindert het aantal neurotransmitters uitgescheiden door één vesikel compartimenten4,14,15,16,17,18,19. De uitleg van deze opmerkingen hebben gespeculeerd over de mogelijke verbetering van macromoleculaire verdringing in de cel cytoplasma remmende vesikel fusion gebeurtenissen, en een wijziging in de membraan biofysische eigenschappen waardoor het aantal neurotransmitters uitgebracht tijdens exocytose. Deze gedachten verondersteld dat hoge extracellulaire osmotische stress niet afdoet aan het blaasje quantal formaat, waarin het aantal moleculen van de neurotransmitter opgeslagen in een blaasje compartiment voorafgaande stadium van geactiveerde exocytose14, 15 , 17 , 19 , 20 , 21. in amperometrische metingen van exocytose release in afzonderlijke cellen, een koolstofvezel schijf micro-elektrode in nauw contact met het celoppervlak, maken een experimentele opgericht nabootsen van de configuratie van de synaps wordt geplaatst waar de amperometrische elektrode fungeert als een postsynaptisch detector (Figuur 1)22,23. Door het stimuleren van een cel exocytose, kan een neurotransmitter gevulde blaasjes te smelten met de celmembraan van plasma en vrijgeven van de volledige vesikel inhoud geheel of gedeeltelijk in de extracellulaire ruimte veroorzaken. Deze neurotransmitter moleculen vrijgegeven aan het oppervlak van de elektrode kunnen elektrochemisch worden gedetecteerd als de neurotransmitters electroactive (bijvoorbeeld, catecholamines zijn) door toepassing van een redoxpotentiaal meet van +700 mV vs een Ag/AgCl-elektrode . Daarom een aantal huidige spikes markeren de detectie van individuele exocytose gebeurtenissen. Van de huidige versus tijd traceren in een amperometrische-opname, het gebied onder elke één amperometrische spike vertegenwoordigt de lading per exocytose evenement gedetecteerd en kan worden geconverteerd naar het molletje van neurotransmitters uitgebracht, met behulp van de vergelijking van Faraday. Vandaar, de opnames amperometrische kwantitatieve informatie verschaffen over de hoeveelheid neurotransmitters verdreven uit één exocytose gebeurtenissen en verslag over de frequentie van exocytose gebeurtenissen, maar vertonen geen kwantitatieve informatie over de secretoire blaasjes inhoud voordat vesikel fusion en neurotransmitter release is ingeleid.

Dus, om een beter begrip van hoe secretoire blaasjes in de cel cytoplasma reageren op extracellulaire osmotische stress voordat de cel wordt geactiveerd om te ondergaan exocytose, andere aanvullende analytische methoden kunnen worden gebruikt om deze informatie te verrijken. Bijvoorbeeld, om te onderzoeken als osmotische stress vesikel volume verandert, kan transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) imaging analyse worden gebruikt voor het meten van het vesikel grootte van cellen na chemische fixatie. Om te onderzoeken of osmotische stress beïnvloedt vesikel quantal grootte, een techniek van de onlangs ontwikkelde amperometrische genaamd intracellulaire elektrochemische cytometry, kan worden toegepast voor de kwantificering van vesikel neurotransmitter inhoud op secretoire blaasjes in hun geboortestaat toen nog woonachtig in het cytoplasma van levende cellen26. In de intracellulaire elektrochemische cytometry techniek, een nanotip cilindrische koolstofvezel elektrode zachtjes wordt ingevoegd in het cytoplasma van levende cellen en door het toepassen van een potentieel +700 mV op deze elektrode (versus een Ag/AgCl referentie elektrode), de Catecholamine inhoud in blaasjes kan worden gekwantificeerd door de detectie van een redox huidige piek van enkele blaasjes botsen, adsorberend, en vervolgens stochastically te bezwijken aan de elektrode oppervlakte en daardoor het vrijgeven van hun inhoud tegen de elektrode oppervlakte26. Vandaar, in de huidige versus tijd trace amperometrische, elk één vesikel rupturing evenement kan resulteren in een huidige voorbijgaande aard en door de integratie van het gebied van elke huidige spike, de vesikel quantal grootte kan worden berekend met behulp van Faraday´s-wet.

Dus door het koppelen van de kwantitatieve informatie opgedaan vesikel grootte metingen met behulp van TEM imaging samen met blaasje quantal grootte analyse, zoals geregistreerd door intracellulaire elektrochemische cytometry, kan blaasje neurotransmitter concentratie ook worden bepaald. Dit maakt de karakterisering van het vesikel wanneer cellen worden blootgesteld aan verschillende osmotische omstandigheden en biedt een betere blik op hoe de blaasjes op extracellulaire osmotische stress in het stadium vóór de exocytose reageert. De resultaten van combinatie van deze methoden hebben aangetoond dat in aanwezigheid van extracellulaire hoge osmotische druk, blaasjes krimpen en hun quantal grootte aanpassen en vergelijken van de kwantitatieve informatie over de relatieve veranderingen van deze metingen dat blijkt tijdens het krimpen wijzigen blaasjes hun inhoud en het formaat te handhaven van een constante neurotransmitter concentratie24. Dus, dit inzicht is waardevol bij het aansluiten van de opmerkingen over neurotransmitter vrijlating in cellen die zijn blootgesteld aan osmotische stress. In deze protocollen beschrijven we het gebruik van deze drie complementaire methoden waarmee de karakterisatie van hoe secretoire blaasjes in hun oorspronkelijke omgeving reageren op extracellulaire osmolaliteit en de gevolgen van deze reactie op de exocytose proces. Naast onze eerdere opmerkingen over het effect van hoge osmotische druk op exocytose24presenteren we extra experimenten die cel herstel na osmotische schok en het effect van meerdere barium stimulaties in chromaffin beschrijven cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. de celcultuur van boviene Chromaffin cellen geïsoleerd door enzymatische spijsvertering van de bijnieren

  1. Isoleren chromaffin cellen verkregen boviene bijnieren, steriliseren cellen met 70% ethanol oplossing. Trim weg vet en bindweefsel met behulp van een scalpel. Om het bloed te verwijderen, spoel de bijnier aderen met behulp van Locke's oplossing (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, NaHCO3 3.6 mM, hydroxyethyl piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) 5,6 mM met een pH van 7,4) die al waterbaden tot 37 ° C.
  2. Te verteren van het weefsel, opblazen van elke klier door het injecteren van ongeveer 2,5 mL warme steriele gefiltreerd 0,2% collagenase P oplossing door de bijnier ader met een injectiespuit en Incubeer het weefsel gedurende 20 minuten bij 37 ° C. Onderzoeken van de klieren om ervoor te zorgen dat de spijsvertering van de medulla is voltooid. Het weefsel moet zacht en niet gespannen aanvoelen.
  3. Verzamelen de medulla verteerd door het knipprogramma uit de klieren in de lengterichting. Mince de medulla weefsel met behulp van een scalpel. Filteren van de weefsel-schorsing over een stalen zeef en Verdun met Locke's oplossing voor ongeveer een 50 mL volume om de activiteit van collagenase P.
  4. Pellet de cellen bij 300 x g in een centrifuge gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en in 50 mL steriele reageerbuisjes verzamelen. Resuspendeer de pellet verkregen in 20 mL Locke de oplossing en filtreer de oplossing over een steriele 100-µm nylon gaas in buizen.
  5. Meng de chromaffin celsuspensie met steriele Percoll (1:1) en centrifugeer de cell oplossing bij 18,600 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Verzamelen van de bovenste laag van het verloop van de dichtheid en filtreer de oplossing over een 100-µm nylon gaas in buizen.
  6. Als u wilt uitsluiten van Percoll, Verdun de celsuspensie met Locke's oplossing en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur voordat opnieuw de pellet in Locke's oplossing wordt verbroken. De geschatte celdichtheid van de geïsoleerde celsuspensie is ongeveer 4 miljoen cellen/mL.
  7. Voor amperometrische opname van exocytose en intracellulaire cytometry metingen, plaat chromaffin cellen in collageen IV gecoat 60 mm kunststof gerechten bij een dichtheid van ongeveer 17,5 × 10-3 -cellen/cm2 en Incubeer de cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 milieu. De elektrochemische experimenten uitvoeren binnen 1-3 dagen van celkweek.
  8. Voor de TEM imaging experimenten, plaat chromaffin cellen in 75 cm2 cel cultuur kolven bij een dichtheid van 7-8 miljoen cellen per kolf en Incubeer bij 37 ° C in een omgeving met 5% CO2 voor 1 dag.

2. eencellige exocytose Amperometry experimenten24

  1. Om koolstofvezel microelectrodes voor deze experimenten, nemen een glazen capillair met een buitendiameter geschikt voor de elektrode-houder het hoofd stadium die zal worden gebruikt in deze experimenten. Gebruik een borosilicaatglas capillair met een buitendiameter van 1.2 mm en een inwendige diameter van 0,69 mm.
    1. Een van de capillaire uiteinden verbinden met een buis water aspiratie. Plaats 5 µm diameter carbon vezels op iets, zoals een stuk wit papier, ter verbetering van visualisatie.
    2. Identificeren van een enkele koolstofvezel en de vezel onderdruk aan de ene kant met een vinger de koolstofvezel in plaats te houden terwijl de positionering van het open uiteinde van het capillair in nabijheid van het vrije uiteinde van de koolstofvezel. Zachtjes de koolstofvezel in de glazen capillaire gecombineerd, zodat de koolstofvezel door beide uiteinden van het capillair steekt. Opzijschuiven de aspiratie-kracht.
  2. Plaats het capillair met de koolstofvezel in een micropipet trekker en trek de glazen capillaire in twee aparte glazen pipet tips. Gebruiken als u wilt verbreken van de koolstof-vezel dat is aangesloten tussen de twee glazen tips, een paar van schaar te snijden de koolstofvezel en twee koolstofvezel microelectrodes krijgen.
  3. Onder een Microscoop, plaats de koolstofvezel bovenop een dikkere microscoopglaasje waarmee handmatig snijden van de koolstofvezel aan de rand van waar de vezel breidt uit de glazen capillaire coating met behulp van een scalpel.
  4. Na het snijden van de koolstof-vezel, verlaten van een glas gecoate koolstofvezel tip, kunt u het een paar mm van de elektrode tip invoegen door een Epoxy-oplossing voor 10 min te trekken van epoxy en verzegelen alle mogelijke open ruimte tussen de koolstofvezel en het omliggende glas. Til de elektroden langzaam uit de epoxy-oplossing om te voorkomen dat omvangrijk lijm druppels vormen aan het uiteinde van de elektrode.
  5. Plaats de elektroden op een houder (bijvoorbeeld, een houten platte stok) met twee-kant hittebestendig plakband waarop elektroden aangesloten kunnen worden. Bak de epoxy behandeld elektroden 's nachts in een oven bij 100 ° C. De elektrode tips gemakkelijk breken als ze in contact met een oppervlak komen, dus zorg ervoor de elektroden altijd veilig worden opgeslagen met behulp van een houder waar de elektroden worden opgelost in plaats en tips doen niet het risico lopen geraakt.
  6. Voor het verkrijgen van een platte schijf elektrode oppervlakte, plaats van de elektrode in de houder van een microgrinder en schuine elke koolstofvezel elektrode op een engel van 45°. Na afschuining, markeren het capillair aan de bovenzijde met behulp van een permanent marker later weten hoe om te zoeken van de schijf elektrode oppervlakte onder een hoek van 45°, bij het plaatsen van de elektrode in de buurt van cellen voor de meting van exocytose.
    Opmerking: Deze stap is belangrijk in deze experimenten, de ovale schijf elektrode moet plat op cellen met haar oppervlakte parallel aan het oppervlak van de petrischaal worden geplaatst. Afschuining elektroden zijn ook dezelfde dag als experimenten om een frisse en schone elektrode oppervlakte gedaan.
  7. Vóór gebruik, door elke koolstofvezel micro-elektrode in een blanco-oplossing (bijvoorbeeld, 0,1 mM dopamine in PBS buffer (pH 7.4)) als u wilt controleren van de huidige cyclische voltammetrie met steady-state te plaatsen. Voor een cyclische voltammetrie scan, gelden de potentiële golfvorm van een driehoek -0,2 V tot 0,8 V vs een Ag/AgCl-elektrode op 100 mV/s om goede reactie kinetica gegevens worden verkregen die zijn in overleg met de theoretisch berekende waarden voor een schijf van 5 µm diameter koolstofvezel micro-elektrode25.
  8. Voor de opname van de amperometry van exocytose, plaats de petrischaal met gekweekte chromaffin cellen op een omgekeerde Microscoop. Het is belangrijk om te beschermen de Microscoop opgericht met een kooi van Faraday om elektronische storingen tijdens de opname, als gevolg van de zeer kleine stromen wordt gemeten amperometry te elimineren. Een Microscoop verwarming fase gebruiken om een temperatuur van 37 ° C tijdens de experimenten van de cel.
  9. Gebruik een geluidsarme patch klem instrument toe te passen van een constante potentieel van +700 mV op de elektrode werken ten opzichte van een referentie-elektrode Ag/AgCl die ook in de petrischaal uit de buurt van de werken-elektrode is geplaatst. Voor opname exocytose van chromaffin cellen, digitaliseren van het signaal op 10 kHz en toepassing van een interne low-pass Bessel-filter op 2 kHz voor het filteren van het opgenomen signaal.
  10. Mount standaardinteracties amperometrische opname op afzonderlijke cellen, de schijf vers schuine en geteste koolstofvezel micro-elektrode in de elektrode-houder van de hoofd etappe die wordt gebruikt met de potentiostaat.
    1. Voorzichtig plaats van de elektrode met de vlakke ovale schijf vorm elektrode oppervlakte naar beneden richting het apicale oppervlak van de cel en plaats van de elektrode in contact met de celmembraan met behulp van een micromanipulator.
    2. Aanpassen van de afstand van de elektrode naar de cel door controle van de vervorming van de cel veroorzaakt door de elektrode na plaatsing op de top van de celmembraan en vervolgens zorgvuldig het intrekken van de elektrode tot op een afstand waar de cel een shape dicht bij de oorspronkelijke vorm van de cel herwint . Het ideaal voor kinetische en kwantitatieve opnemen is het creëren van een dunne vloeistof film van honderd nanometer te scheiden van de elektrode en de cel-oppervlakte, die soortgelijke voorwaarden postsynaptisch detectie voor chemische release in een synaps.
  11. Om te stimuleren van de cellen die moeten exocytose, plaatst u een glas micropipet met een grootte van de tip van 2-3 µm diameter, gevuld met 5 mM BaCl2 oplossing op een afstand van ten minste 20 µm ergens buiten de cel, om te voorkomen dat elke oplossing uit het uiteinde van de pipet om invloed uit te lekken de experimenteren en een 5 s injectie puls van 5 mM BaCl2 oplossing bij het celoppervlak ter stimulering van de cel exocytose van toepassing.
  12. De omkeerbare effecten van osmotische druk op het proces van exocytose studeren, bereiden een isotone bufferoplossing (150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM MgCl2, glucose 5 mM, 10 mM HEPES, pH 7.4) met 310 mOsm/kg iso-osmotische druk en een hypertonic buffer gemaakt door aanpassing van de De concentratie van de NaCl isotone Bufferoplossing met een osmolaliteit overeenkomt met 730 mOsm/kg.
  13. Plaats van de cellen in de isotone buffer en de cel exocytose stimuleren door een puls van barium injectie toe te passen tijdens het opnemen van de huidige transiënten van amperometrische tijdens de ingewijden exocytose activiteit voor ongeveer 3 min.
    1. Om te vergelijken de exocytose reacties in isotone voorwaarden op hypertonic voorwaarden, Incubeer de cellen gedurende 10 minuten in hypertonic bufferoplossing en daarna een barium injectie puls stimuleren van exocytose en uitvoeren van 3 min van amperometrische opname toe te passen.
    2. Voor de omkeerbare reactie van cellen, cellen opnieuw gedurende 10 minuten in isotone bufferoplossing uit te broeden en cellen stimuleren door toepassing van een 5s barium injectie pulse en het uitvoeren van 3 min van de opname van de reactie van de exocytose van de cel.
  14. Als controle experimenten bij het vaststellen van het effect op exocytose activiteit door meerdere barium stimulaties, uit te voeren een amperometrische opname van exocytose release van drie opeenvolgende BaCl2 stimulaties op dezelfde cel geplaatst in isotone buffer en met behulp van de dezelfde tijd-protocol voor de opeenvolgende cel incubatie experimenten met verschillende osmolariteit.

3. de intracellulaire elektrochemische Cytometry24,26

  1. Om vesikel quantal grootte metingen-meet-elektroden, gebruiken de zelfde materialen en beginnen met de voorbereiding van een 5 µm in diameter koolstofvezel elektrode volgens de beschrijvingen in de punten 2.1 en 2.2 van de fabricage van de micro-elektrode voor amperometrische exocytose metingen.
  2. Onder een Microscoop, gebruik u een scalpel te snijden de koolstofvezel uitbreiden uit het puntje van het glas zodat er een koolstofvezel met een lengte variërend van 30 tot 100 µm overblijft van het glas puntje uitsteekt.
  3. Ter voorbereiding van een vlam geëtste tip van de elektrode koolstofvezel, gebruik een butaan vlam. Om te bereiken een gelijkmatig geëtst, cilindrische gevormde elektrode tip, houdt de cilindrische gevormde koolstofvezel elektrode terwijl draaien en plaats de koolstofvezel zich uitstrekt van het glas in de blauwe rand van de butaan vlam totdat het uiteinde van de koolstof een rode ontwikkelt Kleur. Dit duurt vaak minder dan 2 s. Als dat lukt, resulteert dit in een geëtste elektrode tip grootte van 50-100 nm in diameter (een SEM-beeld van zo'n tip is afgebeeld in Figuur 5B). Na vlam etsen, plaats de elektrode onder een microscoop te evalueren van de elektrode-tip.
  4. Plaats de cilindrische nanotip micro-elektrode in epoxy oplossing voor 3 min, gevolgd door een 15 s dompelen van de elektrode-tip in een oplossing van aceton. Hierdoor kan de epoxy te verzegelen van de potentiële ruimte van de kloof tussen de koolstofvezel en de isolerende glazen capillaire wand, terwijl de aceton de epoxy vandoor naar de geëtste koolstofvezel elektrode oppervlakte wist. Om te genezen van de epoxy, bak de elektroden in een oven's nachts bij 100 ° C.
  5. Vóór gebruik, testen de steady-state-stroom van elke koolstofvezel micro-elektrode, zoals uiteengezet in punt 2.7 met behulp van cyclische voltammetrie. Alleen gebruiken voor experimenten, elektroden die weer een plateau huidige rond 1,5 tot 2,5 NB27.
  6. Bij metingen van de intercellulaire amperometry, plaats van de cellen op de Microscoop als beschreven in 2.8 en gebruiken dezelfde experimentele instellingen van de potentiostaat zoals beschreven in 2.9.
  7. Intracellulaire amperometrische meting uitvoeren, en om te voorkomen dat aanzienlijke fysieke schade op de cel, de nanotip cilindrische micro-elektrode in de cel invoegen door het toevoegen van een zachte mechanische kracht, net genoeg om het duwen van de elektrode door middel van het plasma cel membraan en in het cytoplasma van de cel met behulp van een micromanipulator.
  8. Na inbrengen, en met de celmembraan rond de cilindrische elektrode verzegeld, de amperometrische opname ter plaatse bij de levende cel te starten. Op de oxidatie potentiële die is toegepast op de elektrode, blaasjes zal adsorberen aan de elektrode oppervlakte en stochastically scheuren.  Vandaar, is er geen behoefte aan enige vorm van stimulans om met dit proces begint.
  9. Om te bepalen van de osmotische effect op vesikel quantal grootte, de intracellulaire cytometry metingen van een groep cellen die hebben zijn geïncubeerd in isotone en hypertonic buffer met de experimentele conditie zoals beschreven in sectie 2.13 te verzamelen.

4. data-analyse van Amperometry opnames

  1. De opgenomen amperometry om gegevens te analyseren van exocytose en intracellulaire vesikel quantal grootte analyse, het gebruik van een softwareprogramma waarmee analyse van huidige transiënten in de opgenomen stroom versus tijd trace dus dat kinetische parameters van de piek en de geïntegreerde totale kosten voor individuele huidige pieken kan worden bepaald. Voor data-analyse, hebben we software die is ontwikkeld in het lab Sulzer die werd geschreven voor de data analyseprogramma Igor28gebruikt.
  2. Wanneer het analyseren van de amperometrische pieken, selecteert u een drempel voor pieken van drie maal de wortel-gemiddelde vierkante (RMS) standaardafwijking van het geluid voor elke opname.
  3. De spikes amperometrische verzamelen van elke cel opname handmatig om te voorkomen dat valse pieken die niet de Gaussiaanse vorm volgt, dubbele pieken die kunnen worden van het resultaat van samengevoegde exocytose gebeurtenissen, en accepteren alleen Gaussian gevormde aren met een drempel van driemaal hoger dan de RMS-geluid.
  4. Verzamel de gegevens voor de totale kosten per één amperometrische piek en Faradays wet gebruiken (N = QnF) om de molaire hoeveelheid catecholamine neurotransmitter gedetecteerd per exocytose of intracellulaire één vesikel breuk evenement, waarbij N staat voor de mol te berekenen neurotransmitters gaan door een redoxreactie op de elektrode oppervlakte, Q = de totale kosten gedetecteerd onder elke piek, n = aantal elektronen overgebracht in de redoxreactie (n = 2 voor catecholamines), en de Faraday´s constante F = 96485 C/mol.
  5. Het uitvoeren van statistische analyse van de gegevens verzameld door de eerste berekening van de gemiddelde kosten per gebeurtenis voor elke cel gedetecteerd. Vervolgens voor variantie tussen cellen, berekenen van de gemiddelde kosten tussen de cellen en een student t-test gebruikt tussen cellen uitgaande van ongelijke variantie. Deze studie gebruikt de MATLAB-programma voor statistische analyse.

5. TEM Imaging vesikel grootte p.a.

  1. Voor het uitvoeren van TEM beeldvorming van cellen op de verschillende osmotische voorwaarden, incubeer eerst de cellen in een isotone of hypertonic buffer gedurende 10 minuten bij 37 ° C in een 5% CO2 omgeving voordat chemische fixatie van de cellen.
  2. Fixatie van de cel met behulp van de Karnovsky kleefpoeders methode29uitvoeren Met behulp van deze methode, Incubeer de cellen met een oplossing die natriumazide 0,01%, 1% formaldehyde en 1,25% Glutaaraldehyde waarin het monster kan worden achtergelaten bij 4 ° C.
  3. Wassen na fixatie, de cellen met 0,15 M natrium cacodylate buffer.
  4. Om de cel vlek monsters post fixatie, en ter voorbereiding van TEM imaging, Incubeer de cellen met een oplossing van 1% osmium tetroxide gedurende 2 uur bij 4 ° C, gevolgd door 1 uur incubatie in 0,5% uranyl acetaat oplossing bij kamertemperatuur in het donker.
  5. In een laatste fixatie stap, de cellen eerst uitdrogen door het spoelen van de cellen in 100% ethanol en spoel cellen met aceton.
  6. De celsteekproeven insluiten in epoxyresin en daarna centrifugeren bij 4000 x g voor 30-40 min uitvoeren en het monster van de cel aan het polymeriseren bij 40 ° C gedurende 15 h gevolgd door 48 uur broedtijd bij 60 ° C.
  7. Voorbereiding voor imaging, sectie het monster cel ingesloten in Agar 100 hars in plakjes met dikte van 60 nm met behulp van een ultramicrotome.
  8. Onderwerp van de cellen tot een oplossing van 4% uranyl acetate/25% ethanol voor 4 min, gevolgd door 20 s van spoelen met water. Wassen van de cellen met Reynolds lood citraat gedurende 3 minuten, gevolgd door 20 s van spoelen met water.
  9. Transmissie Electronenmicroscopie beeldvorming van celsteekproeven uitvoeren In onze experimenten, hebben we gebruik gemaakt van een transmissie-elektronenmicroscoop die heeft geopereerd op 120 kV.
  10. Van elke geregistreerde afbeelding van een cel sectie illustreren de cel ultrastructuur waarin een bevolking van de blaasjes in het cytoplasma van de cel, eerst kalibreren de grootte van de pixel van de afbeelding door pixels die betrekking hebben op de bar van de opgenomen schaal in elke afbeelding TEM. Imaging software gebruiken voor het bepalen van de grootte van het vesikel op elk beeld van cellen die zijn blootgesteld aan isotone of hypertonic voorwaarden. In onze experimenten gebruikten we de software ImageJ voor beeldanalyse. Het is vermeldenswaard dat voor beeldanalyse van cellulaire ultrastructuur van TEM beelden van cellen, grootte aanpassing van deze metingen op basis van de dikte van de cel secties moet worden beschouwd en zijn eerder beschreven door Almers´s lab30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We beschrijven hier het protocol voor hoe TEM imaging samen met twee elektrochemische methodologieën, koolstofvezel amperometry en intracellulaire elektrochemische cytometry, combineren kunt informeren die krijgt een bredere visie zinspeelt op het effect van extracellulaire osmotische druk op secretoire blaasjes en het proces van exocytose. Door het vergelijken van representatieve amperometrische opnames van exocytose release op één chromaffin cellen met behulp van de experimentele instellen (afgebeeld in Figuur 1), werd een significante vermindering van exocytotic activiteit weergegeven wanneer cellen werden blootgesteld aan osmotische benadrukken ten opzichte van de cellen in de isotone voorwaarden (figuur 2A)24. Van deze opnames en met behulp van Faraday´s-wet, de totale kosten gedetecteerd door elke afzonderlijke amperometrische huidige spike werd gebruikt voor het berekenen van het aantal moleculen één vesikel exocytose evenementen op cellen die zijn blootgesteld aan de verschillende uitgezet osmotische voorwaarden. Ter vergelijking, zoals weergegeven in figuur 2B door het kleinere gebied van het huidige gemiddelde amperometrische spike gedetecteerd door cellen in hypertonic oplossing, minder neurotransmitter moleculen zijn uitgebracht van elk blaasje door cellen sensing osmotische stress24 .

Om te bepalen van de omkeerbaarheid van deze daling in het aantal moleculen van de neurotransmitter uitgebracht, we uitgevoerd amperometrische opnames van exocytose op cellen die zijn blootgesteld aan een hypertonic omgeving en vervolgens op cellen na terug in een isotone geplaatst milieu. In deze experimenten, chromaffin cellen werden gestimuleerd drie opeenvolgende keer met BaCl2 oplossing: eerst in een isotone buffer, gevolgd door een tweede stimulatie nadat cellen werden geïncubeerd gedurende 10 minuten in een hypertonic oplossing en, ten slotte, een derde stimulatie na een incubatieperiode van de cel van de 10 min in isotone voorwaarden. De resultaten presenteren zoals weergegeven in figuur 3A dat de hoeveelheid neurotransmitters uitgebracht met ~ 50% was verminderd wanneer cellen werden blootgesteld aan de hypertonic voorwaarde ten opzichte van de eerste Ba2 + stimulatie in de isotone voorwaarde. Vervolgens, wanneer cellen werden teruggebracht naar een isotone omgeving en aan een derde Ba2 + stimulatie onderworpen, de neurotransmitter van de bedrag vrijgegeven per exocytose evenement werd omgekeerd terug naar het oorspronkelijke bedrag opgenomen in de eerste stimulatie, die vorige opmerkingen14bevestigd. Controle experimenten met drie opeenvolgende Ba2 + stimulaties van cellen in de isotone voorwaarde tonen (Zie figuur 3B) aan dat meerdere opeenvolgende Ba2 + stimulaties isotone onder de hoeveelheid neurotransmitter niet gewijzigd uitgebracht tijdens exocytose. Dit suggereert dat blaasje quantal grootte snel en omkeerbaar is aangepast met de extracellulaire osmolariteit.

Echter bij het analyseren van de amperometrische sporen van deze experimenten in termen van exocytose activiteit, werd het duidelijk, zoals weergegeven in figuur 4A, die exocytose activiteit was aanzienlijk belemmerd wanneer cellen werden blootgesteld aan hypertonic stress. Tijdens de stress van de osmotische, werden exocytose evenementen gereduceerd tot 12% van de activiteit op cellen in een isotone conditie. Vervolgens, nadat de osmotische schok en cellen terug in een isosmotic omgeving geplaatst waren, herwonnen cellen 41% van hun originele activiteit van exocytose. Interessant is dat de controle experimenten uitgevoerd in isotone voorwaarden toonde, zoals weergegeven in figuur 4B, dat na het uitvoeren van drie opeenvolgende BaCl2 stimulaties, de frequentie van exocytose gebeurtenissen werd verlaagd tot 53% na een tweede stimulatie en verder tot 26% door de derde stimulatie vergeleken met de eerste stimulatie. Vandaar, is het duidelijk dat opeenvolgende Ba2 + stimulaties niet lijken te invloed op het aantal neurotransmitters vrijgesteld van elke vesikel wanneer exocytose wordt geactiveerd, maar beduidend de efficiëntie van het vesikel release-proces beïnvloeden is.

Om te onderzoeken hoe secretoire blaasjes in hun eigen omgeving worden beïnvloed door extracellulaire osmotische stress in termen van vesikel volume of quantal grootte, blaasje grootte analyse met behulp van TEM imaging werd gecombineerd met intracellulaire elektrochemische cytometry op cellen blootgesteld aan isotone en hypertonic voorwaarden. In de intracellulaire elektrochemische cytometry experimenten, werd een koolstofvezel nanotip elektrode ingevoegd in het cytoplasma van levende chromaffin cellen wanneer geplaatst in isotone en hypertonic oplossing (zoals weergegeven in Figuur 5). De resulterende amperometrische huidige piek werd gecontroleerd van elk blaasje in het cytoplasma van de cel botsen, adsorberend, stochastically bezwijken en het vrijgeven van het vesikel inhoud aan het oppervlak van de elektrode amperometrische op barsten van26. De geïntegreerde totale kosten voor elke piek in de huidige versus tijd trace ontdekt werd gebruikt voor de berekening van de gemiddelde vesikel quantal grootte in elke cel opnemen Faraday´s bedrijfsvoorschrift. Deze intracellulaire elektrochemische cytometry metingen, in Figuur 6 afgebeelde en figuur 7B, aangetoond dat blaasje quantal in cellen die zijn blootgesteld aan de stress van de osmotische waren aanzienlijk verkleind ten opzichte van op cellen in isotone voorwaarden. Vergelijking van de omvang van de wijziging in de quantal grootte vesikel zoals gemeten door intracellulaire elektrochemische cytometry, de fractionele daling in de hoeveelheid neurotransmitter uitgebracht tijdens exocytose op cellen extracellulaire osmotische stress ervaren , sprake van een relatieve daling van 60% in zowel de grootte van de quantal en de hoeveelheid neurotransmitter uitgebracht ten opzichte van op cellen in isotone voorwaarden (Figuur 7)24. Om te hebben betrekking op de aanpassing in vesikel quantal grootte tot een mogelijke variatie in vesikel neurotransmitter concentratie van cellen ervaren osmotische druk, werd TEM beeldanalyse uitgevoerd om te bepalen van de grootte van de vesikel van cellen die zijn blootgesteld aan isotone en hypertonic voorwaarden. Bovendien, de donkere verkleuring van de dichte kern eiwit matrix binnen de LDCVs die is gevisualiseerd in de TEM-beelden als een donkere bol in het membraan blaasjes gebonden werd gebruikt voor het meten van de omvang van de dichte kern matrix in deze blaasjes. Als aangegeven in Figuur 8, was vesikel verkleind tot 60% op cellen die zijn blootgesteld aan de extracellulaire osmotische stress ten opzichte van op cellen in isotone voorwaarden. Uit de berekende hoeveelheid de gemeten diameter van de LDCV en de dichte kern, het volume van de omliggende halo-oplossing blijkt dat een duidelijke oplossing binnen de LDCVs in de TEM-beelden was ook berekend. De beknopte resultaten van de beeldanalyse TEM toonde, zoals weergegeven in Figuur 8, dat het volume van de halo-oplossing in de LDCVs die tijdens de extracellulaire osmotische schok het is voornamelijk24verminderd.

Figure 1
Figuur 1 : Één cel exocytose amperometry. Een schematische voorstelling van de experimentele set-up voor amperometrische meting van exocytose op één chromaffin cellen24. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: amperometrische sporen van exocytose metingen.  (A) een representatieve amperometrische opname van exocytose op chromaffin cellen in isotone (zwarte kleur) en in de extracellulaire omgeving hypertonic (rode kleur). (B) uitbreiding van een gemiddelde amperometrische spike uit exocytose meting van chromaffin cellen in isotone (zwart) en hypertonic (rood) extracellulaire omgevingen24. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : De omkeerbaarheid van het aantal catecholamines vrijgegeven op exocytose na osmotische schok. (A) het aantal moleculen uitgebracht tijdens exocytose van chromaffin cellen (n = 4) door drie opeenvolgende Ba2 + stimulaties, met de eerste stimulatie in isotone, de tweede in hypertonic, en de derde in isotone buffer. De statistische resultaten van de ongepaarde t-test worden weergegeven. De p -waarde voor de vergelijking van de eerste Ba2 + stimulatie (Ba2 + stim 1) in de isotone buffer met de tweede Ba2 + stimulatie (Ba2 + stim 2) in hypertonic buffer is p= 0.1088 en de p-waarde voor de vergelijking van de tweede Ba2 + stimulatie in hypertonic oplossing met de derde Ba2 + stimulatie (Ba2 + stim 3) in de isotone buffer is p = 0.059. (B) controle-experiment demonstreren de hoeveelheid neurotransmitter moleculen vrijgegeven op drie opeenvolgende Ba2 + stimulaties van chromaffin cellen (n = 4) in de isotone buffer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : Het effect van de osmotische druk op exocytose activiteit. (A) het effect van extracellulaire osmolariteit op exocytose activiteit wordt gepresenteerd als de frequentie van exocytose gebeurtenissen bij chromaffin cellen (n = 4) worden gestimuleerd met bariumhydroxyde-oplossing in isotone, dan hypertonic, en ten slotte in isotone voorwaarden. De waarden worden voorgesteld als het gemiddelde aantal spikes van elke cel en het gemiddelde van alle cellen bemonsterd (standaardfout van het gemiddelde (SEM)). De statistische significantie van wijzigingen wordt gepresenteerd met behulp van een t-toets voor ongepaarde gegevens (de p -waarde voor isotone Ba2 + stimulatie 1 en hypertonic Ba2 + stimulatie 2 is p= 0.0126 en de p-waarde voor de vergelijking van hypertonic Ba2 + stimulatie 2 en isotone Ba2 + stimulatie 3 is p= 0.037). (B) controle-experiment presenteren de frequentie van exocytose gebeurtenissen na drie opeenvolgende barium stimulaties op chromaffin cellen (n = 4) in de isotone voorwaarden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : De elektrochemische cytometry van de intracellulaire vesikel te controleren van wijzigingen in het vesikel quantal grootte. (A) een schematische voorstelling van de experimentele instellen gebruikt voor intracellulaire elektrochemische cytometry. (B) een scannen elektronenmicroscopie beeld van een typische nanotip conische carbon fiber elektrode24. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : Intracellulaire elektrochemische cytometry metingen tonen (A) representatieve sporen van intracellulaire amperometrische cytometry opnames in chromaffin cellen in isotone (zwart) en hypertonic (rood) extracellulaire omgevingen. (B) uitbreiding van een gemiddelde amperometrische spike van intracellulaire cytometry meting bij chromaffin cellen in isotone (zwart) en hypertonic (rood) extracellulaire omgevingen24. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7 : Kwantificering van het aantal catecholamines vrijgegeven op exocytose en bepaling van de quantal grootte van de vesikel. (A) het gemiddelde aantal moleculen uitgebracht tijdens exocytose opnames op chromaffin cellen in isotone (n = 22) en hypertonic (n = 20) omgevingen. De waarden worden gepresenteerd als een gemiddeld aantal moleculen vrijgegeven per exocytose evenement van elke cel en gemiddeld uit de cellen bemonsterd (± SEM). De statistische significantie van de wijzigingen zijn gepresenteerd met behulp van de t-toets voor ongepaarde gegevens (p -waarde = 0.0003) (B) het gemiddeld aantal moleculen per vesikel opgespoord door intracellulaire elektrochemische cytometry op chromaffin cellen in isotone (n = 19) en hypertonic (n = 16) voorwaarden. De waarden worden voorgesteld als het gemiddelde aantal moleculen per spike genotypes van elke cel en gemiddeld uit alle cellen bemonsterd (± SEM). De statistische significantie van wijzigingen wordt gepresenteerd met behulp van t-test voor ongepaarde gegevens (p - waarde = 0.0108)24. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8 : Effect van de osmotische druk op grote dichte kern vesikel grootte. De berekende volume worden gecontroleerd van de LDCVs, de dichte kern-eiwitten en de oplossing van de halo rond de dichte kern eiwit matrix werd berekend in attolitres (aL) van beeldanalyse van TEM beelden van chromaffin cellen in isotone (n = 12) en hypertonic (n = 9) buffers. De resultaten werden verzameld uit een gemiddelde van 311 blaasjes per cel en gemiddelden van afzonderlijke cellen (± SEM). De p-waarden zijn gemeld uit ongepaarde t-tests isotone en hypertonic buffers te vergelijken. De P-waarde is 0.0385 (*) voor vesikel volume, 0.3967 voor dichte kern volume, 0.0047 (*) voor halo volume24. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wij presenteren hier een protocol en de voordelen van de combinatie van drie elkaar aanvullende analytische methoden om secretoire blaasjes en het proces van exocytose te krijgen een beter begrip van hoe een fysieke kracht zoals osmotische druk secretoire blaasjes beïnvloeden kan te analyseren en het proces van exocytose in secretoire cellen. Deze methoden omvatten koolstofvezel micro-elektrode amperometry, die een gevestigde methode is voor het opnemen van exocytose activiteit, intracellulaire elektrochemische cytometry, die wordt gebruikt om te bepalen van de quantal grootte van blaasjes in hun eigen omgeving, en Transmissie Electronenmicroscopie beeldanalyse secretoire vesikel volume controleren. In dit werk, door het verzamelen van kwantitatieve gegevens van de opnamen van de amperometry van enkele vesikel exocytose evenementen op chromaffin cellen blootgesteld aan een isotone en een hypertonic extracellulaire omgeving, we bevestigd dat osmotische schok vermindert het installatieprogramma de bedrag neurotransmitters uitgebracht tijdens exocytose en dat deze cellen omkeerbaar kunnen herstellen en vrijgeven van de oorspronkelijke hoeveelheid, indien terug in een isotone milieu (Figuur 3) geplaatst.

De opnames amperometrische verstrekte informatie van de frequentie van exocytose gebeurtenissen tegen de tijd en kunnen daarom ook worden gebruikt om te controleren van wijzigingen in exocytose activiteit op cellen in verschillende osmotische omgevingen. Deze gegevens kan worden geïnterpreteerd en gebruikt om te onderscheiden of wijzigingen in de activiteit direct of als een functie van de tijd plaatsvinden. Zoals wij in vorige werk, toonde hoewel osmotische stress belemmerd exocytotic activiteit, lijkt het niet te belemmeren de fusie van de gemakkelijk vrij te geven pool van blaasjes24. De activiteitsgegevens exocytose kan ook worden gebruikt voor het analyseren van de totale exocytotic activiteit gedurende een periode van opnametijd. Hier presenteren we het opgebouwde aantal exocytose gebeurtenissen uit een 3 minuten durende opname van exocytose op chromaffin cellen blootgesteld aan de twee verschillende osmotische voorwaarden. Deze gegevens wijzen op een remming exocytose activiteit van cellen osmotische stress en dat een gedeeltelijke herstel van deze activiteit kan worden bereikt na cellen terugkeer naar een extracellulaire isotone omgeving ervaren. Heel belangrijk, toonde de controle-experimenten echter dat meerdere Ba2 + stimulaties binnen het tijdsbestek gebruikt in deze experimenten een significante vermindering van exocytose activiteit veroorzaakt door telkens die een cel werd gestimuleerd om afscheiding. Door de derde opeenvolgende Ba2 + stimulatie, slechts een derde van de exocytose activiteit werd gehandhaafd, en duidelijk de barium, en misschien ook de timing van de stimulaties in deze experimenten, de cyclus van het vesikel was beïnvloedt. Zou dit relevant is voor het uit te leggen waarom exocytotic activiteit werd teruggevonden in de cellen geplaatst in isotone oplossing na de osmotische schok en waarom deze cellen weergegeven een soortgelijke relatieve daling in activiteit vergeleken met cellen in isotone voorwaarden na drie sequentiële Ba2 + stimulaties. Vandaar, amperometry opname van exocytose biedt informatie over secretoire blaasjes vanaf het moment dat de blaasjes worden geactiveerd om te fuseren met het plasma-membraan, het vrijgeven van neurotransmitters via de porie fusion. Daardoor kwantitatieve gegevens over één vesikel neurotransmitter release en informatie over de activiteiten van exocytose kan worden verzameld.

De hoeveelheid neurotransmitter uitgebracht kan worden geregeld door de wijze van exocytose die wordt geactiveerd, waar de volledige vesikel inhoud en/of deel van de inhoud wordt afgevoerd. Door het bestuderen van uitsluitend exocytose uitgave gebruikt koolstofvezel amperometry die detecteert alleen wat een blaasje is uitgezet, is het moeilijk te onderscheiden als een verandering in de aangetroffen hoeveelheid neurotransmitter vrijgegeven gerelateerd is aan een wijziging in de geactiveerde modus van Exocytose, een verandering in de cellulaire biofysische eigenschappen beïnvloeden vesikel inhoud release, of aan veranderingen in het vesikel quantal grootte. Daarom door aangevuld deopname amperometrische van exocytose met metingen met behulp van de intracellulaire elektrochemische cytometry, in situ metingen van de quantal grootte van de vesikel bij levende cellen kunnen worden gekenmerkt en vandaar gebruikt om te vergelijken de Fractie van vesikel inhoud release van blaasjes tijdens exocytose26.

In dit werk, we om te onderzoeken als het blaasje quantal formaat werd beïnvloed door osmotische stress, deze techniek voor de kwantificering en de evaluatie van de quantal grootte van de vesikel bij cellen blootgesteld aan isotone en hypertonic voorwaarden toegepast. Inbrengen van de nanotip-elektrode in het cytoplasma van een levende cel is tamelijk invasieve beschouwd, deze experimenten werden slechts eenmaal uitgevoerd per cel en niet werden herhaald op dezelfde cel. Deze experimenten worden daarom bij voorkeur uitgevoerd als afzonderlijke metingen uit groepen van willekeurig geselecteerde cellen blootgesteld aan een isotone en een hypertonic extracellulaire omgeving. Om te vergelijken veranderingen in vesikel quantal grootte zoals gemeten door intracellulaire elektrochemische cytometry tot wijzigingen in de hoeveelheid neurotransmitter vrijgegeven op exocytose, men zou moeten overwegen de proefomstandigheden van intracellulaire opname matching en ook uitvoeren amperometry opname van exocytose op afzonderlijke willekeurige cellen. Als studies worden uitgevoerd op de dezelfde eencellige, is het belangrijk in deze experimentele protocollen om de invloed van opeenvolgende BaCl2 stimulaties ook te overwegen en ervoor te zorgen dat de experimentele omstandigheden overeenkomen met de kolomlabels gebruikt voor de intracellulaire cytometry metingen. Het is ook vermeldenswaard dat het is moeilijk om de exacte plaatsing en de diepte van de elektrode wanneer een cel wordt ingevoegd. Elke cel biedt dus een aselecte steekproef vesikel quantal grootte p.a.. Bovendien, indringende vesikel quantal grootte met behulp van deze methode wordt geen onderscheid gemaakt van verschillen in, bijvoorbeeld, blaasje looptijd en daarom ook zou kunnen toevoegen variatie naar maten. Intracellulaire experimenten bleek dat blaasje quantal werd verkleind op cellen aan de extracellulaire osmotische druk blootgesteld. De relatieve afname van de quantal grootte gedetecteerd door deze methode werd vergeleken met de opmerkingen van relatieve veranderingen in neurotransmitter release tijdens exocytose. Deze studie bleek dat de relatieve daling van de grootte van de quantal op dezelfde volgorde als de daling van de neurotransmitter release op cellen sensing osmotische stress.

Om te controleren of dat als osmotische stress was het veranderen van de concentratie van de neurotransmitter blaasje, het blaasje volume werd geëvalueerd aan de hand van TEM imaging analyse voor chemisch vaste chromaffin cellen die waren blootgesteld aan isotone en hypertonic voorwaarden. TEM imaging analyse toonde aan dat blaasjes krimpen wanneer cellen worden blootgesteld aan een osmotische schok en dat de relatieve afname van de grootte is aangepast samen met de vesikel quantal grootte te handhaven van een constante neurotransmitter concentratie24. De TEM beeldanalyse, waarin sprake is van een nanometer beeldresolutie kunt onderscheiden van de twee fasen, de dichte kern eiwit matrix en de omliggende halo oplossing binnen LDCVs, en dus maakt het mogelijk om het volume van dichte kern eiwit matrix en het volume van de halo-oplossing berekenen. Uit deze analyse, was de daling in volume van het vesikel vastbesloten om worden voornamelijk verband houden met een afnemende volume van de oplossing van de halo rond de dichte kern eiwit matrix24.

Kortom, deze studie presenteert een protocol aan te tonen hoe drie analytische methoden worden gecombineerd, en karakterisering van secretoire blaasjes voordat neurotransmitter kunt release en wat worden vrijgegeven van deze blaasjes wanneer cellen worden getriggerd wordt om te Exocytose, krijgen een beter begrip van hoe secretoire blaasjes en cel functies zoals exocytose wordt beïnvloed door extracellulaire stress. Dit protocol kan ook worden gebruikt voor het beantwoorden van vragen over hoe neurotransmitter release op exocytose en vesikel quantal grootte wordt beïnvloed door andere wijzigingen in de fysieke omgeving of potentiële geneesmiddelen die invloed kunnen hebben op secretoire cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedank de Zweedse Onderzoeksraad (349-2007-8680) voor financiering en Dalsjöfors Kött AB (Dalsjöfors, Zweden) voor donatie van boviene bijnieren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Sigma Aldrich S7653
KCl Sigma Aldrich P9333
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
HEPES Sigma Aldrich H3375
MgCl2 Sigma Aldrich M-2670
Glucose Sigma Aldrich G8270
Collagenase P Roche, Sweden 11 213 857 001
100-µM Nylon mesh Fisher Sientific 08-771-19
Percoll Sigma Aldrich P1677
Collagen IV coated 60 mm plastic dish VWR 354416
Centrifuge Avanti J-20XP
Borosilicate glass capillary Sutter instrument Co., Novato, CA
Micropipette puller Narishing Inc., Japan PE-21
Epoxy solutions (A and B) Epoxy technology, Billerica, MA
Beveller Narishing Inc. EG-400
Inverted Microscope Olympus IX81
Patch clamp Instrument Molecular Devices, Sunnyvale, CA Axopatch 200B
Micromanipulator Burleigh Instrument Inc., USA PCS-5000
Butane Flame Multiflame AB, Hässelholm, Sweden
Transmission electron microscopy Omega Leo 912 AB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  2. Dunevall, J., et al. Characterizing the Catecholamine Content of Single Mammalian Vesicles by Collision-Adsorption Events at an Electrode. J Am Chem Soc. 137 (13), 4344-4346 (2015).
  3. Crivellato, E., Nico, B., Ribatti, D. The chromaffin vesicle: advances in understanding the composition of a versatile, multifunctional secretory organelle. Anat Rec. 291 (12), 1587-1602 (2008).
  4. Morris, S., Schultens, H., Schober, R. An osmometer model for changes in the buoyant density of chromaffin granules. Biophys J. 20 (1), 33 (1977).
  5. Winkler, H., Smith, A. D. The chromaffin granule and the storage of catecholamines. Handbook of Physiology. 6 (7), 321-399 (1975).
  6. Phillips, J., Allison, Y., Morris, S. The distribution of calcium, magnesium, copper and iron in the bovine adrenal medulla. Neurosci. 2 (1), 147-152 (1977).
  7. Estévez-Herrera, J., et al. ATP: The crucial component of secretory vesicles. Proc Natl Acad Sci. 113 (28), 4098-4106 (2016).
  8. Machado, J. D., Camacho, M., Alvarez, J., Borges, R. On the role of intravesicular calcium in the motion and exocytosis of secretory organelles. Commun integr biol. 2 (2), 71-73 (2009).
  9. Toll, L., Howard, B. D. Role of Mg2+ ion-activated ATPase and a pH gradient in the storage of catecholamines in synaptic vesicles. Biochemistry. 17 (13), 2517-2523 (1978).
  10. Terland, O., Flatmark, T. Ascorbate as a natural constituent of chromaffin granules from the bovine adrenal medulla. FEBS letters. 59 (1), 52-56 (1975).
  11. Camacho, M., Machado, J. D., Montesinos, M. S., Criado, M., Borges, R. Intragranular pH rapidly modulates exocytosis in adrenal chromaffin cells. J Neurochem. 96 (2), 324-334 (2006).
  12. Jankowski, J. A., Schroeder, T. J., Ciolkowski, E. L., Wightman, R. M. Temporal characteristics of quantal secretion of catecholamines from adrenal medullary cells. J Biol Chem. 268 (20), 14694-14700 (1993).
  13. Daniels, A., Williams, R., Wright, P. The character of the stored molecules in chromaffin granules of the adrenal medulla: a nuclear magnetic resonance study. Neurosci. 3 (6), 573-585 (1978).
  14. Borges, R., Travis, E. R., Hochstetler, S. E., Wightman, R. M. Effects of external osmotic pressure on vesicular secretion from bovine adrenal medullary cells. J Biol Chem. 272 (13), 8325-8331 (1997).
  15. Troyer, K. P., Mundorf, M. L., Fries, H. E., Wightman, R. Separating vesicle fusion and exocytosis in hypertonic conditions. Ann NY Acad Sci. 971 (1), 251-253 (2002).
  16. Brodwick, M. S., Curran, M., Edwards, C. Effects of osmotic stress on mast cell vesicles of the beige mouse. J Membrane Biol. 126 (2), 159-169 (1992).
  17. Amatore, C., Arbault, S., Bonifas, I., Lemaitre, F., Verchier, Y. Vesicular exocytosis under hypotonic conditions shows two distinct populations of dense core vesicles in bovine chromaffin cells. Chem Phys Chem. 8 (4), 578-585 (2007).
  18. Hampton, R. Y., Holz, R. W. Effects of changes in osmolality on the stability and function of cultured chromaffin cells and the possible role of osmotic forces in exocytosis. J Cell Biol. 96 (4), 1082-1088 (1983).
  19. Troyer, K. P., Wightman, R. M. Temporal separation of vesicle release from vesicle fusion during exocytosis. J Biol Chem. 277 (32), 29101-29107 (2002).
  20. Pihel, K., Travis, E. R., Borges, R., Wightman, R. M. Exocytotic release from individual granules exhibits similar properties at mast and chromaffin cells. Biophys J. 71 (3), 1633 (1996).
  21. Jankowski, J. A., Finnegan, J. M., Wightman, R. M. Extracellular ionic composition alters kinetics of vesicular release of catecholamines and quantal size during exocytosis at adrenal medullary cells. J Neurochem. 63 (5), 1739-1747 (1994).
  22. Leszczyszyn, D. J., et al. Nicotinic receptor-mediated catecholamine secretion from individual chromaffin cells. Chemical evidence for exocytosis. J Biol Chem. 265 (25), 14736-14737 (1990).
  23. Wightman, R., et al. Temporally resolved catecholamine spikes correspond to single vesicle release from individual chromaffin cells. P Natl Acad Sci. 88 (23), 10754-10758 (1991).
  24. Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. -S. Extracellular osmotic stress reduces the vesicle size while keeping a constant neurotransmitter concentration. ACS Chemical Neuroscience. , (2017).
  25. Bath, B. D., et al. Subsecond adsorption and desorption of dopamine at carbon-fiber microelectrodes. Anal Chem. 72 (24), 5994-6002 (2000).
  26. Li, X., Majdi, S., Dunevall, J., Fathali, H., Ewing, A. G. Quantitative Measurement of Transmitters in Individual Vesicles in the Cytoplasm of Single Cells with Nanotip Electrodes. Angew Chem Int Edit. 54 (41), 11978-11982 (2015).
  27. Zoski, C. G., Mirkin, M. V. Steady-state limiting currents at finite conical microelectrodes. Anal Chem. 74 (9), 1986-1992 (2002).
  28. Mosharov, E. V., Sulzer, D. Analysis of exocytotic events recorded by amperometry. Nat Methods. 2 (9), 651-658 (2005).
  29. Morris, J. K. A formaldehyde glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol. 27, 137-139 (1965).
  30. Parsons, T. D., Coorssen, J., Horstmann, H., Almers, W. Docked granules, the exocytic burst, and the need for ATP hydrolysis in endocrine cells. Neuron. 15 (5), 1085-1096 (1995).

Tags

Neurowetenschappen kwestie 132 Chromaffin cellen osmotische druk dichte kern blaasjes neurotransmitter concentratie quantal grootte exocytose amperometry intracellulaire cytometry transmissie-elektronenmicroscopie
Toezicht op het Effect van de Stress van de osmotische op secretoire blaasjes en exocytose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fathali, H., Dunevall, J., Majdi,… More

Fathali, H., Dunevall, J., Majdi, S., Cans, A. S. Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis. J. Vis. Exp. (132), e56537, doi:10.3791/56537 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter