Toepassing van de Aorta-gonaden-mesonephros Explant cultuur System in Developmental Hematopoiesis
Summary
Dit protocol beschrijving van het gebruik van gekweekte Aorta-gonaden-Mesonephros voor expressie analyses, kolonie-vormende eenheden in de cultuur en milt, en op lange termijn reconstitutie om te bepalen van het effect van regelgevende factoren en signaalroutes op hematopoietische stamcellen cel ontwikkeling. Dit is aangetoond als een doeltreffend systeem voor het bestuderen van hematopoietische stamcelbiologie en functie.
Abstract
De beperking van het gebruik van de muis embryo’s voor Haematopoiese studies is de toegevoegde overlast in operaties, die grotendeels te wijten aan de uteriene ontwikkeling van het embryo. Hoewel de genetische gegevens van knock-out (KO) muizen zijn overtuigend, is het niet realistisch voor het genereren van KO muizen voor alle genen zoals nodig. Bovendien uitvoeren in vivo redding experimenten te consolideren van de gegevens die zijn verkregen van KO muizen is niet handig. Deze beperkingen wilt opheffen, werd de Aorta-gonaden-Mesonephros (AVA) explant cultuur ontwikkeld als een passend systeem te bestuderen van hematopoietische stamcellen (HSC) ontwikkeling. Vooral voor redding experimenten, kan het worden gebruikt om te herstellen van de verminderde Haematopoiese in KO muizen. Door toevoeging van de juiste chemische stoffen in het medium, de verminderde signalering kan worden gereactiveerd of trajecten omhoog-geregeld kunnen worden geremd. Met het gebruik van deze methode, vele experimenten kunnen worden uitgevoerd om te identificeren van de kritische toezichthouders van HSC ontwikkeling, met inbegrip van HSC gerelateerde genexpressie bij mRNA en proteïne niveaus, kolonie vorming vermogen en reconstitutie capaciteit. Deze reeks experimenten zou nuttig zijn bij het vaststellen van de onderliggende mechanismen van essentieel belang voor de ontwikkeling van de HSC in zoogdieren.
Introduction
Hematopoietische stamcellen (HSCs) zijn weefsel-specifieke adulte stamcellen die bezitten multilineage potentieel, met inbegrip van erythroid, myeloïde, en lymfoïde cellen, evenals de mogelijkheid om zichzelf te vernieuwen. Recente studies hebben aangetoond dat de vroegste HSCs voortkwam uit een gespecialiseerde endothelial bevolking, bekend als hemogenic-endotheel (HE), door middel van het endotheel hematopoietische overgang (EHT) bij de ventrale muur van dorsale aorta1,2 ,3,4. Eenmaal gevormd in de aorta-gonaden-mesonephros (AVA) regio van embryonale (E) 10.5 tot E12.5 in het embryo van de muis, zal HSCs migreren in de foetale lever voor uitbreiding en tot slot het koloniseren van het beenmerg om volwassen Haematopoiese gedurende iemands leven 5 , 6. Hoewel dit heeft onderzocht voor vele jaren, de onderliggende mechanismen van HSC opkomst en ontwikkeling blijven onvolledig begrepen.
In tegenstelling tot in vitro bevruchting en ontwikkeling van zebravis embryo’s, anticonceptie ontwikkeling van muis embryo’s maakt de studie van definitieve Haematopoiese tijdens de embryogenese veel meer lastig. Hoewel genetische experimenten met behulp van knock-out (KO) muizen vaak gebruikt zijn, beperkt het gebrek aan bepaalde KO muizen ook hun gebruik in de hematopoietische onderzoeksveld. Daarnaast worden in vivo redding experimenten niet gemakkelijk uitgevoerd in KO muizen. Sinds 1996, de AGM explant cultuur ontwikkeld voor hematopoietische studies door de pioniers in het veld7. Met de hulp van dit systeem van cultuur, zijn ventrale weefsels van de AVA-regio vastgesteld ter bevordering van HSC activiteit, terwijl de dorsale weefsels oefenen een tegenovergestelde effect8,9. De AVA explant cultuur systeem is ook toegepast voor het vaststellen van de rollen van serotonine, Mpl, SCF, BMP en Hedgehog signalering in HSC ontwikkeling10,11,12,13, 14. nog belangrijker is, het is ook een populaire methode gebruikt om te redden van hematopoietische gebreken in mutant embryo’s13,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het is algemeen bekend dat volwassen HSCs in het beenmerg weer aan de bloed-systeem van bestraalde ontvangers toevoegen kunnen. In tegenstelling tot deze functionele HSCs zijn de nieuwe HSCs in de AVA van muis embryo’s onvolwassen. Directe transplantatie resultaten toonden aan dat type ik (VE-CAD-+ CD45– CD41+) en type II (VE-CAD-+ CD45+) pre-HSCs bezitten geen reconstitutie vermogen20. Profiteren van de AVA explant cultuur systeem, de ontluik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij bedanken Suwei Gao voor hulp bij voorbereiding van de figuur. Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale Natural Science Foundation van China (81530004, 31425016) en het ministerie van wetenschap en technologie van China (2016YFA0100500). J.L. de experimenten uitgevoerd en opgesteld van het manuscript; F.L. bewerkt het manuscript. Beide auteurs lezen en het laatste manuscript goedgekeurd.
Materials
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
References
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129, 4891-4899 (2002).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86, 897-906 (1996).
- Peeters, M., et al. Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development. Development. 136, 2613-2621 (2009).
- Taoudi, S., Medvinsky, A. Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta. PNAS. 104, 9399-9403 (2007).
- Crisan, M., et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).
- Durand, C., et al. Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells. PNAS. 104, 20838-20843 (2007).
- Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis. Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).
- Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med. 214, 529-545 (2017).
- Souilhol, C., et al. Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells. Nature communications. 7, 10784 (2016).
- Fitch, S. R., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).
- Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).
- Ortiz, J., Artigas, F. Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine. Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).
- Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine. Life sciences. 15, 471-479 (1974).
- Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature. 457, 887-891 (2009).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).
- Muthuswamy, S. K. Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead. Development. 144, 963-967 (2017).
