विकास Hematopoiesis में महाधमनी-gonad-mesonephros Explant कल्चरल सिस्टम का आवेदन
Summary
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है cultureed महाधमनी-Gonad-Mesonephros अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए, संस्कृति और प्लीहा में कॉलोनी बनाने इकाइयों, और दीर्घकालिक पुनर्गठन विनियामक कारकों और टेम स्टेम पर संकेत रास्ते के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए सेल विकास । यह टेम स्टेम सेल जीवविज्ञान और समारोह के अध्ययन के लिए एक प्रभावी प्रणाली के रूप में प्रदर्शित किया गया है ।
Abstract
hematopoiesis अध्ययन के लिए माउस भ्रूण का उपयोग करने की सीमा आपरेशन में जोड़ा असुविधा है, जो काफी हद तक भ्रूण के अंतर्गर्भाशयी विकास के कारण है । हालांकि नॉकआउट (KO) चूहों से आनुवंशिक डेटा कायल कर रहे हैं, यह सभी जीन के लिए चूहों को जरूरत के रूप में पैदा करने के लिए यथार्थवादी नहीं है । इसके अलावा, से चूहों से प्राप्त डेटा को मजबूत करने के लिए vivo बचाव प्रयोगों में प्रदर्शन सुविधाजनक नहीं है. इन सीमाओं को दूर करने के लिए महाधमनी-Gonad-Mesonephros (एजीएम) explant कल्चर को टेम स्टेम सेल (HSC) विकास का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त प्रणाली के रूप में विकसित किया गया । विशेष रूप से बचाव प्रयोगों के लिए, यह KO चूहों में बिगड़ा hematopoiesis को ठीक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । मध्यम में उपयुक्त रसायनों को जोड़ने के द्वारा, बिगड़ा संकेत सक्रिय किया जा सकता है या अप-विनियमित रास्ते बाधित किया जा सकता है. इस विधि के उपयोग के साथ, कई प्रयोगों HSC विकास के महत्वपूर्ण नियामकों की पहचान करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है, mRNA और प्रोटीन के स्तर पर HSC संबंधित जीन अभिव्यक्ति, कॉलोनी गठन की क्षमता, और पुनर्गठन क्षमता सहित. प्रयोगों की यह श्रृंखला स्तनधारियों में HSC विकास के लिए आवश्यक अंतर्निहित तंत्र को परिभाषित करने में सहायक होगी ।
Introduction
टेम स्टेम सेल (HSCs) ऊतक विशिष्ट वयस्क स्टेम सेल कि erythroid, माइलॉयड, और लसीकावत् कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्वयं को नवीनीकृत करने की क्षमता सहित multilineage क्षमता के अधिकारी हैं । हाल के अध्ययनों से पता चला है कि जल्द से HSCs एक विशेष endothelial जनसंख्या से उठी, hemogenic endothelium के रूप में जाना (वह), endothelial के माध्यम से टेम संक्रमण (EHT) पृष्ठीय ventral के महाधमनी दीवार पर1,2 ,3,4. एक बार महाधमनी में गठित-gonad-mesonephros (एजीएम) भ्रूण से क्षेत्र (ई) १०.५ e 12.5 माउस भ्रूण में, HSCs विस्तार के लिए भ्रूण जिगर में विस्थापित और अंत में अस्थि मज्जा उपनिवेश एक व्यक्ति के जीवन भर में वयस्क hematopoiesis बनाए रखने के लिए होगा 5 , 6. हालांकि यह कई वर्षों के लिए अध्ययन किया गया है, HSC उद्भव और विकास के अंतर्निहित तंत्र को पूरी तरह से समझ में रहते हैं ।
इन विट्रो निषेचन और zebrafish भ्रूण के विकास के विपरीत, माउस भ्रूण के अंतर्गर्भाशयी विकास embryogenesis के दौरान निश्चित hematopoiesis का अध्ययन बहुत अधिक असुविधाजनक बनाता है । हालांकि आनुवंशिक नॉकआउट (KO) चूहों का उपयोग प्रयोग आमतौर पर उपयोग किया जाता है, कुछ को चूहों की कमी भी टेम अनुसंधान क्षेत्र में उनके उपयोग की सीमा । इसके अलावा, vivo में बचाव प्रयोगों आसानी से KO चूहों में प्रदर्शन नहीं कर रहे हैं । १९९६ के बाद से, एजीएम explant संस्कृति क्षेत्र में अग्रणी द्वारा टेम अध्ययन के लिए विकसित किया गया है7। इस संस्कृति प्रणाली की मदद से, एजीएम क्षेत्र के ventral ऊतकों HSC गतिविधि को बढ़ावा देने के लिए पहचान की गई है, जबकि पृष्ठीय ऊतकों एक विपरीत प्रभाव डालती है8,9. एजीएम explant कल्चरल सिस्टम में सेरोटोनिन, Mpl, एससीएफ, बीएमपी, और हेज सिग्नलिंग के रोल्स का निर्धारण करने के लिए भी आवेदन किया गया है HSC development10,11,12,13, 14. महत्वपूर्ण बात, यह भी एक लोकप्रिय के उत्परिवर्ती भ्रूण13,15में टेम दोषों से बचाव के लिए इस्तेमाल किया विधि है ।
Protocol
पशु विषय सहित सभी प्रक्रियाओं को इंस्टीट्यूट ऑफ जूलॉजी, चाइनीज एकेडमी ऑफ साइंसेज, बीजिंग, चीन में नैतिक समीक्षा समिति ने अनुमोदित कर दिया है ।
1. सामग्री वडा बंध्याकरण ०.६५ & #181; 4 एच के ल…
Representative Results
Discussion
यह सर्वविदित है कि अस्थि मज्जा में परिपक्व HSCs विकिरणित प्राप्तकर्ताओं के रक्त प्रणाली को फिर से आबाद कर सकते हैं । इन कार्यात्मक HSCs के विपरीत, माउस भ्रूण के एजीएम में उभरते HSCs अपरिपक्व हैं । प्रत्यक्ष ट्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम चित्रा तैयारी में मदद के लिए Suwei गाओ धंयवाद । यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (८१५३०००४, ३१४२५०१६) और चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (2016YFA0100500) से अनुदान द्वारा समर्थित था । जीएल प्रयोगों प्रदर्शन और पांडुलिपि का मसौदा तैयार किया; F.L. ने पांडुलिपि का सम्पादन किया । दोनों लेखकों ने अंतिम पांडुलिपि पढ़ी और उसे मंजूरी दी ।
Materials
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
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