대동맥-생식-mesonephros Explant 문화 시스템 개발 조에의 응용

Summary

조 혈 줄기에 규제 요인 및 신호 통로의 효과 결정 하 식 분석, 문화와 비장, 장기 재구성에 콜로 니 형성 단위에 대 한 교양된 대동맥-생식-Mesonephros를 사용 하 여이 프로토콜에 설명 합니다. 셀 개발입니다. 이 조 혈 줄기 세포 생물학을 연구 하 고 기능에 대 한 효과적인 시스템으로 입증 되었습니다.

Abstract

조 연구에 대 한 마우스 배아를 사용 하 여 제한 주로 태아의 자궁내 개발 하는 작업에 추가 불편입니다. 녹아웃 (KO) 마우스에서 유전자 데이터를 설득 하지만 필요에 따라 모든 유전자에 대 한 코 쥐를 생성할 비현실적 이다. 또한, vivo에서 수행 코 쥐에서 얻은 데이터를 통합 하는 구조 실험은 하지 편리. 이러한 한계를 극복 하기 위해 대동맥-생식-Mesonephros (AGM) explant 문화는 조 혈 줄기 세포 (HSC) 개발을 공부 하는 적절 한 시스템으로 개발 되었다. 구조 실험을 위해 특히 코 쥐에 장애인된 조 복구 사용할 수 있습니다. 매체에 적합 한 화학 물질을 추가 하 여 장애인 신호 재 활성화할 수 있습니다 또는 위로 경로 저해 될 수 있습니다. 이 메서드를 사용 하 여, 많은 실험 HSC 개발의 중요 한 레 귤 레이 터를 식별 하기 위해 수행할 수 있습니다, 그리고 HSC를 포함 하 여 관련 된 mRNA와 단백질 수준, 식민지 형성 능력, 및 재구성 능력에서 유전자 발현. 이 일련의 실험 포유류에 HSC 개발에 필수적인 기본 메커니즘을 정의 하는 데 도움이 될 것 이다.

Introduction

조 혈 줄기 세포 (HSCs)는 자체 갱신 하는 기능 뿐만 아니라 erythroid, 골수성를 포함 하는 multilineage 잠재력 및 림프 세포 조직 관련 성인 줄기 세포 이다. 최근 연구 초기 HSCs 조 혈 등 쪽 대동맥^{1,2의 복 부 벽에 전환 (EHT) 내 피를 통해 (그는), hemogenic endothelium로 알려진 전문된 내 피 인구에서 발생 ,,34}. HSCs 확장을 위한 태아 간으로 이동 되며 마지막으로 개인의 생활 내내 성인 조를 유지 하 골 식민지 대동맥-생식-mesonephros (AGM) 지역에 배아 (E) 10.5에서에서 E12.5 마우스 배아 형성, 면 ^{5 , 6}.이 몇 년 동안 공부 하고있다, 비록 HSC 출현 그리고 발달의 기본 메커니즘 남아 불완전 하 게 이해.

체 외에서 수정 및 zebrafish 태아의 개발와 달리 마우스 배아의 자궁내 개발은 확실 한 조 연구 embryogenesis 동안 훨씬 더 불편. 녹아웃 (KO) 마우스를 사용 하 여 유전 실험은 일반적으로 활용 하 고, 비록 특정 KO 마우스의 부족 또한 조 혈 연구 분야에서 그들의 사용을 제한 합니다. 또한, 구조 실험 vivo에서 KO 생쥐에서 쉽게 수행 하지 않습니다. 1996 년 이래로, AGM explant 문화 분야⁷에 개척자에 의해 조 혈 연구 개발 되었습니다. 이 문화 시스템의 도움으로 관련해 지역의 복 부 조직 등 조직 반대 효과^8,9발휘 하는 동안 HSC 활동, 홍보 확인 되었습니다. AGM explant 문화 시스템 또한 세로토닌, Mpl, SCF, BMP, HSC 개발^10,,1112,13, 신호 고슴도치의 역할 결정에 적용 된 ¹⁴. 중요 한 것은, 그것은 또한 돌연변이 배아^13,15조 혈 결함을 구출 하는 데 사용 하는 인기 있는 방법.

Protocol

동물 주제를 포함 하 여 모든 절차 동물학 연구소, 중국 과학원, 베이징, 중국에서 윤리 검토 위원회에 의해 승인 되었습니다. 1. 재료 준비 Sterilize는 0.65 μ m 필터 자외선 자외선 아래 생산 4 h에 대 한 깨끗 한 벤치에 램프를 레이 2 h 마크 후 필터를 넘겨. 참고: UV 라이트를 사용할 경우 적절 한 보호를 착용. 소독 30 분 동안 121 ° C에 고압 소독 기와 스테인?…

Representative Results

최근 간행물 보고 내 피 세포 유래 세로토닌 관련해13프로 apoptotic 통로 억제 함으로써 HSCs의 생존을 촉진. HSC 개발에 세로토닌의 홍보 효과 확인 하려면 팩 포함 되었다. 선택적 세로토닌 재 이해 억제제 (SSRI)로 부정맥 주변 조직16,,1718세로토닌 재 흡수를 억제 하기 위해 입증 되었습니…

Discussion

그것은 잘 알려진 골 수에서 성숙 HSCs 조사 받는 사람 혈액 시스템을 다시 수 있습니다. 이러한 기능 HSCs 달리 마우스 배아의 AGM에 신흥 HSCs 성숙 하지 않습니다. 직접 이식 결과 유형을 보여 난 (VE-cad⁺ CD45^– CD41⁺) 유형 II와 (VE-cad⁺ CD45⁺) 사전 HSCs 없이 재구성 능력²⁰소유. AGM explant 문화 시스템 관련해 지역에서 초기 HSCs의 활용 이식 분석 결과<su…

Materials

durapore 0.65 µm filters	Millipore	R5BA63787	AGM explant culture
M5300 long-term culture medium	Stem Cell Technologies	5300	AGM explant culture
Trizol	Tiangen	5829	RNA extration
M-MLV reverse transcriptase	Promega	90694	reverse transcription
SYBR Green	Qiagen	A6002	quantatitive real-time PCR
protease inhibitor	Roche	55622	Protein extration
collagenase	Sigma	C2674	digestion of AGM tissues
MethoCult GF M3434 medium	Stem Cell Technologies	3434	CFU-C assay
ultra-low attachment 24-well plates	Costar	3473	CFU-C assay
C57BL/6 CD45.2 mice	Beijing HFK Bioscience Co. Ltd		CFU-S assay
C57BL/6 CD45.1 mice	Beijing HFK Bioscience Co. Ltd		Long-term transplantation
phosphate buffered saline	Life Technologines	8115284	AGM Collection
Penicillin-Streptomycin solution	HyClone	SV30010	AGM explant culture
anti-CD45.2-PE-CY7	eBioscience	25-0454-80	Long-term transplantation
anti-CD45-FITC	eBioscience	11-0451-81	Long-term transplantation
UV lamp	Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD	039-14402	power: 30W
stainless steel mesh	AS ONE SHANGHAI Corporation	2-9817-10	aperture diameter: 2.5 mm
hydrocortisone	Sigma	H0396	selectively diluted into M5300 medium