Применение системы аорто Гонада мезонефрос экспланта культуры в развитии кроветворения
Summary
Этот протокол описывает использование искусственного аорто-Гонада-мезонефрос для выражения анализа, образуя колонии единиц в культуре и селезенке и долгосрочное восстановление для определения влияния нормативных факторов и сигнальных путей на гемопоэтических стволовых развития клеток. Это было продемонстрировано как эффективной системы для изучения биологии гемопоэтических стволовых клеток и функции.
Abstract
Ограничение использования эмбрионов мыши для кроветворения исследования является добавлен неудобства в операции, которая в значительной степени обусловлено внутриутробное развитие эмбриона. Хотя генетических данных от мышей нокаут (KO) являются убедительными, это не реалистично для создания KO мышей для всех генов при необходимости. Кроме того выполнение в естественных условиях спасения экспериментов, чтобы консолидировать данные, полученные от KO мышей не удобно. Чтобы преодолеть эти ограничения, культура экспланта аорто-Гонада-мезонефрос (AGM) был разработан как надлежащей системы для изучения развития гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). Особенно для спасения экспериментов он может использоваться для восстановления нарушение кроветворения в KO мышей. Путем добавления соответствующих химических веществ в среду, нарушением сигнализации может быть реактивирован или вверх регулируется пути можно тормозится. С использованием этого метода многие эксперименты могут быть выполнены для выявления критических регуляторы HSC развития, включая HSC связанных экспрессии генов в мРНК и белка уровнях, способность формирования колонии и воссоздания потенциала. Эта серия экспериментов было бы полезным в определении основных механизмов, необходимых для развития HSC в млекопитающих.
Introduction
Гемопоэтические стволовые клетки (СКК), специфичные для ткани взрослых стволовых клеток, которые обладают мультилинейного потенциалом, включая эритроидные, миелоидной и лимфоидных клеток, а также возможность самостоятельного обновления. Недавние исследования показали, что ранние СКК возникает от специализированный эндотелиальной населения, известный как эндотелий кроветворения (он), через эндотелиальные гемопоэтических перехода (EHT) на брюшной стенке грудной аорты1,2 ,3,4. После того, как сформировалась в аорто Гонада мезонефрос региона (AGM) от эмбриональных (E) 10,5-E12.5 в эмбриона мыши, СКК будет перенести в фетальной печени для расширения и наконец колонизировать костного мозга для поддержания кроветворения взрослых на протяжении всей жизни индивидуума 5 , 6. Хотя это был изучен на протяжении многих лет, основных механизмов HSC эмерджентности и развития по-прежнему неполно понял.
В отличие от в экстракорпорального оплодотворения и развитие зародышей данио рерио внутриутробное развитие зародышей мыши делает исследование окончательного кроветворения во время эмбриогенеза гораздо более неудобным. Хотя обычно используются генетические эксперименты с использованием маскирования (KO) мышах, отсутствие определенных KO мышей также ограничивает их использование в области гемопоэтических исследований. Кроме того в естественных условиях спасения эксперименты не выполняются легко KO мышей. Начиная с 1996 года AGM экспланта культуры был разработан для гемопоэтических исследования пионеров в области7. С помощью этой системы культуры было выявлено брюшной ткани AGM региона содействовать деятельности HSC, в то время как спинной тканей приложить противоположный эффект8,9. AGM экспланта культуры системы также был применен для определения роли серотонина, Mpl, SCF, BMP и еж сигнализации в HSC развития10,11,12,13, 14. Важно отметить, что это также популярным методом, используемым для спасения гемопоэтических дефекты в мутанта эмбрионов13,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хорошо известно, что Зрелые СКК в костном мозге может населить системы крови облученных получателей. В отличие от этих функциональных СКК возникающих СКК в AGM зародышей мыши являются незрелыми. Прямая пересадка результаты показали, что тип я (VE-САПР+ CD45– CD41+) и II типа (VE-?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Гао Suwei за помощь в подготовке рис. Эта работа была поддержана субсидий из национального фонда Китая естественных наук (81530004, 31425016) и Министерство науки и техники Китая (2016YFA0100500). J.L. эксперименты и составлен рукопись; Ф.л. редактировать рукописи. Оба автора читать и одобрила окончательный вариант рукописи.
Materials
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
References
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129, 4891-4899 (2002).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86, 897-906 (1996).
- Peeters, M., et al. Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development. Development. 136, 2613-2621 (2009).
- Taoudi, S., Medvinsky, A. Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta. PNAS. 104, 9399-9403 (2007).
- Crisan, M., et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).
- Durand, C., et al. Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells. PNAS. 104, 20838-20843 (2007).
- Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis. Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).
- Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med. 214, 529-545 (2017).
- Souilhol, C., et al. Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells. Nature communications. 7, 10784 (2016).
- Fitch, S. R., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).
- Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).
- Ortiz, J., Artigas, F. Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine. Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).
- Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine. Life sciences. 15, 471-479 (1974).
- Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature. 457, 887-891 (2009).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).
- Muthuswamy, S. K. Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead. Development. 144, 963-967 (2017).
