אפיון של קרום התא הרחבות ולימוד תפקידיהם סרטן התא אדהזיה דינמיקה
Summary
מחקר זה מדגים את השירות ואת קלות מדידה הרחבה כמותית קרום התא שלה מתאם קיבולת דבק של תאים. בתור דוגמא מייצגת, אנחנו מראים כאן את הפרוטאין הקשורות Dickkopf 3 (DKK3) מעודד היווצרות מוגברת lobopodia תא adhesiveness ב adrenocortical קרצינומה של תאים במבחנה.
Abstract
הרחבת רפרטואר קרום התא של ממיקרו התנהגויות ממאירים שונים של תאים סרטניים, כולל פוטנציאל דבק, הנדידה שלהם. היכולת במדויק לסווג, לכמת תא הרחבות, למדוד את ההשפעה על קיבולת דבק של התא חיוני לקבוע איך איתות התא בהתנהגות התא סרטן ההשפעה של אירועים, תוקפנות. כאן, אנו מתארים את עיצוב במבחנה ואת השימוש תא סיומת כימות שיטה בשיתוף עם assay קיבולת אדהזיה במודל הוקמה במבחנה adrenocortical קרצינומה (ACC). באופן ספציפי, אנו לבחון את ההשפעות של DKK3, מדכאי בשם ולא גורם פרו-בידול, על פנוטיפ סיומת הממברנה של הקו הסלולרי ACC, SW-13. אנו מציעים מבחני אלה כדי לספק פשוטה יחסית, אמין, מדדים interpretable בקלות כדי מודד את המאפיינים הבאים בתנאים שונים ניסיוני.
Introduction
חגיגת Dysregulated איתות ממלא תפקיד קריטי ממאירות adrenocortical1. בין השיטות במחקר זה לחקור אם להחרשת DKK3, מווסת שלילי של חגיגת איתות, מייצג אירוע dedifferentiation בקליפת יותרת הכליה ומעודדת היווצרות הגידול בהקשר של התא-הרחבת רפרטואר שינויים. DKK3 הוא kDa 38 מופרש גליקופרוטאין עם פפטיד האות N-מסוף מחקרים קודמים הדגימו כי ביטויה נאכפים, גרמו מחזור מעצר התא עכבות התנהגות תוקפנית ממאיר, הפוך אפיתל-mesenchymal מעבר2.
ההתנהגות ממאיר של קרצינומה של adrenocortical (ACC) ואת סוגי סרטן אחרים, בחלק, מושפע את היכולת של תאים סרטניים ממשק עם המשטחים שמסביב, כולל של מטריצה חוץ-תאית, אשר בתורו מקלה על גידול התא הפלישה, הגירה3. תפקידו של קרום התא הספציפי של הרחבות בהתקדמות סרטן הוא להיות הפגינו יותר ויותר בהקשרים שונים, בעיקר דרך היווצרות של filopodia. לדוגמה, ביטוי של תעלות סידן מסוג L נמצאה זירוז היווצרות filopodia ולקדם גידול התא הפלישה4. באופן דומה, תמונה מרתקת, אקטין מחייב חלבון מינימלית לידי רקמה נורמלית, היא גם overexpressed בתאי סרטן בשיתוף עם היווצרות filopodia5. היווצרות Lobopodia מאפשרת fibroblasts שאינם ממאירים להעביר ביעילות דרך המטריקס הסלולר במיוחד, עם זאת, הוכח כי fibrosarcoma תאים להסתמך על פעילות מטאלופרוטאז במקום lobopodia כדי להקל על נדידת תאים ו הפלישה6. הראינו את הגידול הזה מדכאי, כולל ראס האגודה תחום המשפחה 1 isoform (RASSF1A), DKK3, יכול פונקציה כדי לשנות אלמנטים cytoskeletal, לקדם היווצרות lamellipodia ו stymie7,מאפיינים פולשני8.
ככזה, חיוני כדי לאפיין את ההשפעות של גנים המעורבים carcinogenesis והקשר שלהן כדי שינויים סיומת קרום התא, במיוחד הערכת היווצרות filopodia, lobopodia ו- lamellipodia בתנאי מבחן. טכניקות המדינה-של-באמנות הנוכחי כוללים את השימוש שיטות מיקרוסקופ משוכללים, תיוג פלורסנט, ו/או מחשב מורכבת אלגוריתמים עבור רכישת נתונים ופרשנות. בעוד ששיטות אלה מספקים כלים אנליטיים חדש ורב עוצמה, המורכבות שלהם מגבילה את השימוש הנרחב שלהם והתאמה של ניסויים בביולוגיה של התא. יתר על כן, כימות מדויק של התבוננות לשינויים תא סיומת מורפולוגיה אינו נמדד בדרך כלל9,10. לעומת זאת, אנחנו מציגים כאן טכניקה במדויק מכמתת תא סיומת שינויים באמצעות טכניקות מיקרוסקופיים סטנדרטיים ושיטות בקלות להתאמה במבחנה . שיטות אלה גם לכמת כל סוג סיומת תא בו-זמנית עבור כל תא ניתח וקבע שינויים כוללים בהתאם לדרישה ברפרטואר סיומת קרום התא. אנו גם מראים כיצד שינויים אלו יכולים להתחבר מאפייני אדהזיה תא.
כדוגמה ניסיוני, אנו נשתמש קו תא שנוצרה בעבר של SW-13, איזור SW-DDK3, אשר יש stably transfected עם pCMV6-הכניסה/DKK3 פלסמיד וקטורים צורונים overexpresses DKK3, גורם המבדילים בלוטת יותרת הכליה. Non-transfected SW-13 תאים ותאים SW-13 stably transfected עם וקטור ריק (pCMV6-ערך), המיועד SW-ניאו, ישמש פקדים ניסיוני.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן נתאר במבחנה כמותיים שיטה לאפיון תא הרחבות עם נוחות, כמה נפילות בור הפארמצבטית אמין זה יכול להיות מיושם בתנאים שונים. יתר על כן, מבחני אדהזיה ו/או תנועתיות פשוטות, הניתנות לכימות, ניתן לבצע בו זמנית לתאם פוטנציאליים תפקודית משמעות השינויים שנצפו בהרחבות קרום התא.
עם ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
קרן גרנט Ohse ממומנת עבודה זו.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11965-092 | Supplemented with fetal bovine serum and penicllin and streptomycin |
| Deulbeco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | 1X solution, used directly |
| 3.7% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute stock solution |
| 0.05% crystal violet | Harleco | 192-12 | Dilute stock solution |
| De-ionized water | NA | NA | NA |
| Microscope with 400X magnification | NA | NA | NA |
| 6-well plates | Corning | 353046 | NA |
| Cell dissociation solution non-enzymatic 1X | Sigma-Aldrich | C5914 | 1X solution, used directly |
References
- Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management. Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).
- Veeck, J., Dahl, E. Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3. Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).
- Jacquemet, G., et al. L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling. Nat Commun. 7, 13297 (2016).
- Machesky, L. M., Li, A. Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis. Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).
- Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells. J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).
- Korah, R., et al. Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma. Molecular cancer. 12, 87 (2013).
- Cheng, J. Y., et al. A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis. BMC cancer. 17 (1), 164 (2017).
- Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities. J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).
- Cliffe, A., et al. Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration. Nat Commun. 8, 14905 (2017).
