Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı
Summary
Bu iletişim kuralı hücreleri hücre microenvironment koruma sırasında bir üç boyutlu ortamda göç ve işgal yeteneklerini ölçmek için kullanılabilir bir ters dikey işgali tahlil açıklar. Bu tahlil nadir ve/veya hassas hücreler için uygundur.
Abstract
3D işgali deneyleri geliştirilmiştir rağmen onların microenvironment bütünlüğünü etkilemeden hücreleri çalışmaya meydan kalır. Boyden odası gerektiren hücreleri özgün kültür konumdan yerlerinden ve yeni bir ortama taşınmış gibi geleneksel 3D deneyleri. Sadece bu microenvironment için içsel hücresel süreçler bozmak yok, ama bu kez bir hücre kaybolmasına neden. Bu nadir, ya da onların microenvironment için son derece hassas hücreler ile ilgili özellikle zorlu sorunlardır. Burada, her iki endişelerini önler bir 3D işgali tahlil gelişimi açıklayın. Bu tahlil, hücreler de içinde küçük bir kaplama ve bir chemoattractant içeren bir ECM Matris hücreleri koydu. Bu herhangi bir hücre öteleme gerektirir ve hücreleri matrisin yukarı doğru istila sağlar. Bu tahlil, hücre işgali gibi hücre morfolojisi kollajen jel içinde değerlendirilebilir. Bu tahlil kullanarak, nadir ve hassas hücreler invaziv kapasitesini karakterize; füzyon meme kanseri hücreleri MCF7 ve Mezenkimal/multipotent arasında ortaya çıkan melez hücreleri (MSCs) kök/stroma hücreleri.
Introduction
Hücre hareketliliği hücreleri bir normal gelişim ve fizyolojik süreçtir. Ancak, değişiklikleri desen ve üretilen hücre göç ve istila için inflamatuar hastalıkları ve kanser metastaz1,2,3gibi patolojik koşullarla ilişkilidir. Metastaz tartışmalı Kanserinde en kötü anlaşılır yönüdür. Metastaz için kanser hücrelerinin ekstra hücresel matris (ECM) aşağılamak, yerel doku ve intravasate istila. Bir kez dolaşımda, kanser hücrelerinin uzak siteye yaymak, extravasate ve ikincil tümörler oluşturur. Bu nedenle, yetenek hücreleri ECM aşağılamak için göç ve istila metastatik potansiyellerini ilgilidir. Çözümlemek ve hücrelerin göç ve işgal yeteneklerini ölçmek için farklı yaklaşımlar geliştirilmiştir. En çok kullanılan yaklaşımlar tahlil, hızlandırılmış mikroskobu ve Boyden odası tahlil şifa yara içerir. Yara iyileşme tahlil4 ve zaman atlamalı mikroskobu hücre göç içine ön fikir verecek basit ve kolay deneyleri var. Ancak, her iki hücre içinde vivovar 3D çevre yansıtmıyor 2D deneyleri vardır. Hücreleri farklı bir 2D bir5,–6karşılaştırıldığında 3D ortamına yanıt çalışmalar göstermiştir. Ayrıca, yara iyileştirici deneyleri çoğaltmak ve nicel sonuçları7,8,9verim için zordur. Tahlil şifa yara 3D bir değişiklik olduğunu, hücre dışlama bölgesi tahlil daha fizyolojik ilgili bir tahlil ama hücre içinde sayı hücre füzyon olaylar10,11 kaynaklanan hibrit hücreler gibi düşük için uygun değil .
Boyden odası tahlil için hücresel çalışmalar ilgili microenvironments sağlar 3 boyutlu bir tahlil olduğunu. Ancak, hücrelerin kendi özgün microenvironment kaldırılacak ve geçirmek ve aşağıya doğru chemoattractant içeren orta istila Boyden tahlil sisteminin üst odaya yatırılması için gerekli. Bu 3D yaklaşım onların microenvironment ve/veya sınırlı sayı10,11,12güvenlik açığı bulunan hücrelerin göç ve işgal yeteneği analiz uygun değildir. Hücre göç ve işgal çözümlemek için yeni bir yaklaşım mikrosıvısal degrade odası tahlil13yaşında. Her ne kadar uygun ve güvenilir geçiş ve işgal çalışmaları, bu tahlil daha pahalı ve teknik olarak tipik bir laboratuvar için zor olabilir. Biz burada hücreleri için onların microenvironment duyarlı da dahil olmak üzere birçok hücre tipleri ile uyumlu ve/veya sınırlı sayıda bir basit ters dikey işgali tahlil tanımlamak. Bu tahlil Hooper ve ark. tarafından önerilen iletişim kuralından adapte oldu 14. bu tahlil, hücreleri kendi özgün microenvironment ve onların geçiş kalır ve işgal chemoattractant11içeren kollajen jel içinde yukarı doğru ilerlerken izlenir. Bu tahlil tekrarlanabilir ve yapılmış en iyi duruma getirilmiş ve 35 mm kültür tabakta doğrulanmış. Farklı hücre kültür boyutları, farklı matrisler veya gücü yapışma ve farklı chemoattractants de dahil olmak üzere farklı tahlil şartlarına adapte. Bu tahlil ilaç bulma işleminin başlangıç tarama için bir vitro platform olarak hizmet verebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, nadir ve/veya onların microenvironment bağımlı olan hücreleri de dahil olmak üzere hücre türü için uygun olan bir basit ters dikey işgali tahlil açıklayın. Bu 3D işgali tahlil hücreler içinde onların orijinal microenvironment kalır ve bir chemoattractant içeren kollajen jel tarafından karşılanmaktadır. Hücreler göç ve kollajen istila. Bu tahlil, hücreler lekeli ve kolayca jel içinde izlenir. Basitlik ve tekrarlanabilirlik Bu testin bir 3D sisteminde kanser hücre göç ve işgali içi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından (NIMHD-G12MD007581) Jackson Devlet Üniversitesi ve savunma, fikir Ödülü 11-1-0205 ABD Bakanlığı çevre sağlığı için RCMI merkezinden destek verdi.
Materials
| MatTek P35G-1.5-10C | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-10-C | mattek glass bottom dishes |
| Rat tail collagen I | Corning, Corning, NY, USA | 354236 | Collagen gel |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | H1758 | HCl |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 10010023 | PBS |
| 10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | D2429 | 10X DMEM |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA | S5761 | NaHCO3 |
| Confocal Fluorescent microscope | Olympus America, Center Valley, PA, USA | Olympus IX81 | Confocal microscope |
| Defined Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA | SH30070.03 | FBS |
| Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope | Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA | 40x NA 0.8 objective | MPLSM |
| Imaris software | Bitplane Inc. Zurich, CH | Imaris 7.5.2 | Imaris software |
| DAPI | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | D9542 | DAPI |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA | 50980487 | PFA |
| α-minimum essential medium | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA | M0894 | |
| MDA-MB-231 | ATCC; Manassas, VA, USA | HBT-22 | |
| MSC | Trivedi and Hematti, 2007 | ||
| 20X lens UPLAPO | Olympus America, Center Valley, PA, USA | 36-064 | Olympus UPLSAPO 20X Objective |
References
- Friedl, P., Brocker, E. B. The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric. Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).
- Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21 (2004).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).
- Sahai, E., Marshall, C. J. Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis. Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).
- Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro. BMC Cancer. 8, 198 (2008).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Poujade, M., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).
- Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis. FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).
- McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types. J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).
- Noubissi, F. K., Ogle, B. M. Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel. Int J Mol Sci. 17, (2016).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).
- Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. Mechanical memory and dosing influence stem cell fate. Nat Materials. 13, 645-652 (2014).
