Linse-gratis Video mikroskopi for dynamiske og kvantitativ analyse af vedhængende cellekultur
Summary
Linse-gratis video mikroskopi gør det muligt for os at overvåge cellekulturer direkte inde i rugemaskinen. Her beskriver vi de fulde protokol, der bruges til at erhverve og analysere en 2,7 dagen lang erhvervelse af kulturperler HeLa celler, fører til et datasæt på 2.2 x 106 målinger af individuelle celle morfologi og 10584 cellecyklus spor.
Abstract
Her, vi viser, at linsen-gratis video mikroskopi gør det muligt for os at samtidig indfange kinetik af tusindvis af celler direkte inde i rugemaskinen, og at det er muligt at overvåge og kvantificere enkelt celler langs flere celle cyklusser. Vi beskriver den fulde protokol, der bruges til at overvåge og kvantificere en HeLa cellekultur 2,7 dage. Første celle kultur erhvervelse er udført med en linse-gratis video mikroskop, og derefter dataene analyseres efter en fire-trins proces: multi bølgelængde holografisk genopbygning, celle-inddeling, celle segmentering og celledeling afsløring algoritmer. Som et resultat, viser vi, at det er muligt at samle en datasæt med mere end 10.000 cellecyklus spor og mere end 2 x 106 celle morfologiske målinger.
Introduction
Overvågning kulturperler pattedyrceller hele flere celle cyklusser og måle præcist Cellestørrelse og celle tør masse er en udfordrende opgave. Flere etiket-frie optiske teknikker er i stand til at udføre denne opgave1,2: fase-shifting interferometri3, digitale holografiske mikroskopi (DHM)4,5,6, 7, quadriwave lateral klipning interferometri8,9 og kvantitative fase tomografi10,11. Disse metoder har ført til mange ny indsigt i forståelsen af cellecyklus i pattedyrsceller. Men de er sjældent kombineret med automatisk celle tracking algoritmer og deres gennemløb er stadig begrænset, når måling celle masse baner1 (N < 20 i henholdsvis3,4,5 , 6). derfor en roman optisk metode er nødvendige for at måle celle masse baner med store statistik (N > 1000).
I dette papir vise vi evne til linse-gratis video mikroskopi til samtidigt billede tusindvis af celler direkte inde i rugemaskinen, og derefter kvantificere enkelt celle metrics langs tusindvis af individuelle cellecyklus spor. Linse-gratis mikroskopi er en kvantitativ fase imaging teknik, som giver mulighed for erhvervelse af fase billede af tætpakkede celler over et meget stort synsfelt (typisk flere snese mm2, her 29.4 mm2)12,13 ,14,15. Flere målinger på det enkelte celle niveau bestemmes, fxcelle område, celle tør masse, celle tykkelse, celle største akse længde og celle skærmformat12,15, fra hvert billede. Derefter, ved at anvende en celle-tracking algoritme, disse funktioner kan afbildes for hver enkelt celle som funktion af eksperiment tid14,15. Derudover ved at registrere forekomsten af celledelinger i celle spor, er det muligt at udvinde andre vigtige oplysninger, som den oprindelige celle tør masse (lige efter celledeling), den endelige tør cellemasse (lige før celledeling) og cellen cyklus varighed, dvs., tiden mellem to på hinanden følgende divisioner15. Alle disse målinger kan beregnes med meget god statistik (N > 1000) da den store synsfelt vil typisk give analyse af 200 til 10.000 celler i en enkelt linse-fri erhvervelse.
For at forklare denne metode baseret på linse-gratis video mikroskopi, beskriver vi protokol for at overvåge og kvantificere en HeLa cellekultur 2,7 dage. Dataanalyse er en fire-trins proces baseret på flere bølgelængde holografisk genopbygning, celle-inddeling, celle segmentering og celledeling algoritmer. Her er det vist at den rumlige opløsning og relativt hurtig framerate (en erhvervelse hvert 10 minut) opnået med denne linse-gratis video mikroskopi opsætning er kompatibel med standard algoritmer, celle-tracking. Den fulde analyse af dette datasæt resulterer i måling af 10,584 celle spor over komplet celle cyklusser.
For at opsummere, er linse-gratis video mikroskopi et kraftfuldt værktøj til automatisk overvåge tusindvis af umærkede, ikke-synkroniserede og umodificerede celler pr. eksperiment; hver celle spores over flere celle cyklusser. Vores målinger giver således gennemsnitsværdien af adskillige celle parametre, men endnu vigtigere, den inter celle variation over en stor population af celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette papir viser vi, at linsen-gratis video mikroskopi kan bruges inde i en inkubator til at fange kinetik af tusindvis af celler. For at beskrive den overordnede metode forklarede vi, hvordan en 2,7 dag time-lapse erhvervelse af HeLa celler i kultur kan analyseres med standard algoritmer, celle-tracking. Resultatet er et datasæt byder 2.2 x 106 celle målinger og 10,584 celle cykelstier. Opkøb blev udført på en kultur af Hela celler med en relativt stor afstand, celle-til-celle (celle tæthed < 500 cel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne har intet at anerkende.
Materials
| Cytonote lens-free video microscope | Iprasense | ||
| Horus acquisition software | Iprasense | ||
| 6-well glass bottom culture plates | MatTek corporation | Part No: P06G-0-14-F | |
| DMEM + GlutaMAX medium | Gibco | ||
| heat-inactivated fetal calf serum | Eurobio | ||
| penicillin and streptomycin | Gibco | ||
| Fibronectin | Sigma Aldrich | ||
| Matlab, image processing toolbox | Mathworks |
References
- Zangle, T. A., Teitell, M. A. Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics. Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).
- Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. New technologies for measuring single cell mass. Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).
- Reed, J., et al. Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry. Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).
- Mir, M., et al. Optical measurement of cycle-dependent cell growth. Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).
- Girshovitz, P., Shaked, N. T. Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization. Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).
- Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy. J Biomed Opt. 15 (3), (2010).
- Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).
- Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy. J Biomed Opt. 17 (7), (2012).
- Aknoun, S., et al. Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion. J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).
- Cotte, Y., et al. Marker-free phase nanoscopy. Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).
- Choi, W., et al. Tomographic phase microscopy. Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).
- Kesavan, S. V., et al. High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy. Sci Rep. 4, 1-11 (2014).
- Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM). Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).
- Pushkarsky, I., et al. Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy. Sci Rep. 4, 4717 (2014).
- Allier, C., et al. Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy. Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).
- Su, T. -. W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip. Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).
- Delacroix, R., et al. Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis. Sci Rep. 7, 39893 (2017).
- Tinevez, J. -. Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2016).
- Popescu, G. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
- Liu, P. Y., et al. Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future. Lab Chip. 16, 634-644 (2016).
- Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters. PLoS One. 6 (11), e27315 (2011).
- Al-Kofahi, O., et al. Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells. Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. Tracking in cell and developmental biology. Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).
- Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells. J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).
- Zocchi, E., et al. Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells. J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).
- Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells. J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).
- Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F. Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).
- Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity. J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).
- Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. On being the right (cell) size. Science. 348 (6236), 1245075 (2015).
- Mathieu, E., et al. Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments. Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).
