تحليل الاتصالات بين وحيدات وخلايا سرطان الثدي الأولية في مصفوفة خارج الخلية استخراج (أكمي)-على أساس نظام ثلاثي الأبعاد
Summary
هنا، يمكننا وصف أسلوب ثقافة ثلاثي الأبعاد لتحليل مورفولوجية الابتدائي خلايا سرطان الثدي، كذلك فيما يتعلق بدراسة تفاعلها المباشر/غير المباشر مع وحيدات ونتائج مثل تدهور الكولاجين وتجنيد الخلايا المناعية والخلايا الغزو، والترويج للالتهابات المتصلة بالسرطان.
Abstract
مضمن في المصفوفة خارج الخلية (ECM)، الخلايا الظهارية العادي والورم وثيقا التواصل مع الخلايا المكونة للدم وغير-المكونة للدم، وبالتالي التأثير على أنسجة طبيعية نتيجة التوازن والمرض إلى حد كبير. الإصابة بسرطان الثدي، المرتبطة بورم الضامة (تامس) تلعب دوراً حاسما في تطور المرض وورم خبيث، والتكرار؛ ولذلك، فهم آليات تشيمواتراكشن الوحيدات إلى ورم المكروية وتفاعلها مع الخلايا السرطانية مهم للسيطرة على المرض. هنا، نحن نقدم وصفاً مفصلاً لنظام ثلاثي الأبعاد (3D) ثقافة المشارك للثدي الخلايا السرطانية (BrC) ووحيدات البشرية. إنتاج خلايا BrC ارتفاع مستويات التنظيم في تفعيل القاعدية، وعادي تي خلية أعرب ويفرز (رنتيس)، الوحيدات chemoattractant البروتين-1 (العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1)، وعامل تحفيز مستعمرة بلعم المحببات (ز-CSF)، بينما في الثقافة المشتركة مع وحيدات، تم إثراء بيتا انترلوكين (إيل)-1 برو-التهابات السيتوكينات (إيل-1β)، وايل-8 جنبا إلى جنب مع مصفوفة ميتالوبروتيناسيس (MMP)-1 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-2 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-10. هذا وورم المكروية ستروما تعزيز مقاومة anoikis في هياكل مثل acini 3D MCF-10A، تشيمواتراكشن وحيدات، والغزو العدواني BrC الخلايا. توفير بديل بأسعار معقولة لدراسة الاتصالات داخل ورم البروتوكولات المقدمة هنا وهي مثال على الإمكانات الكبيرة التي توفر في المختبر نظم خلية ثلاثية الأبعاد استجواب ميزات محددة بيولوجيا الأورام المتصلة بالورم العدوان.
Introduction
بيولوجيا الأورام الآن أكثر تعقيداً مما كان يعتقد سابقا. أدلة متزايدة تظهر أن الخلايا السرطانية أكثر من مجرد الجزء الأكبر من الخلايا المتكاثرة غير المنضبط؛ بدلاً من ذلك، تبدو الخلايا الورمية المختلفة لأداء وظائف مختلفة عرض عالية التنظيم والتسلسل الهرمي داخل الورم1. الخلايا السرطانية أيضا في التواصل الحميم مع عدم تحول الخلايا: الضامة، والخلايا الليفية، الخلايا الليمفاوية، adipocytes، خلايا بطانية، بين الخلايا الأخرى كلها مغمورة في سقالة البروتينات والسكريات التي تشكل إدارة المحتوى في المؤسسة. يتم إنشاء العديد من التفاعلات المباشرة وغير المباشرة بين الخلايا المحولة وعدم تحويلها، ومع إدارة المحتوى في المؤسسة، التي تمارس تأثيراً قويا على مدى ال2،نتائج المرض3. في قضية محددة من BrC، من المهم خاصة أن تشريح تبليغ الخلايا BrC مع تامس، إذ ترى أنه تم العثور تامس تلعب دوراً حاسما في تطور الورم، يزيد من مخاطر ورم خبيث، وتكرار المرض4 ،5.
لتحليل التفاعلات داخل الأورام ونتائجها المحتملة، نهج جديدة ثلاثية الأبعاد في المختبر وقد وضعت استناداً إلى استخدام مقتطفات إدارة المحتوى في المؤسسة التي تقدم المكروية أكثر تعقيداً بكثير، أقرب إلى واقع الأحياء الورم، بالمقارنة مع الثقافات الخلية أحادي الطبقة التقليدية التي تنمو فيها الخلايا المرفقة بالبلاستيك. بيترسن وبيسيل6 قدم أول نموذج من نونماليجنانت والخلايا الظهارية الثديية الخبيثة مثقف في غشاء الطابق السفلي الغنية laminin وكانوا الأول من وصف هياكل أورجانوتيبيك ثلاثية الأبعاد التي تميز الإنسان نونماليجنانت الثدي الخلايا الظهارية من نظرائهم الخبيثة. عقد من الزمان في وقت لاحق، النموذج الذي وضعته Debnath, موثوسوامي، وبروج7،،من89 توفير أداة قيمة توضيح الممرات البيولوجية للخطر أثناء التحول الخبيث من غدي acini، هذه كتشكيل acini كبيرة بسبب الانتشار غير المنضبط، توطن البروتينات مفرق ضيق كدليل على استقطاب الخلية البصر، وفقدان التجويف acini نتيجة لمقاومة الخلية anoikis، نوع من موت الخلايا المبرمج الذي يحدث في مرسى-تعتمد على الخلايا عند أنها فصل من ECM المحيطة بها. نماذج ساميني، جيديسزكو، وسلوان ركزت على النشاط proteolytic التصوير بالخلايا، الذي يرتبط ارتباطاً وثيقا اختزاع، سمة حاسمة أخرى من الورم الخبيث10،،من1112. تعتمد هذه النماذج على مصفوفات البروتين مختلطة مع ركائز البروتين تطفئ الأسفار المختلفة (الجيلاتين DQ، DQ-الكولاجين الأول والرابع DQ-الكولاجين)، في إشارات الفلورسنت التي هي إرشادية لتدهور الكولاجين proteolytic. نماذج ثلاثية الأبعاد وتستخدم أيضا لدراسة خصائص الخلايا الجذعية غير تحول على حد سواء، والخلايا السرطانية، كما وصف المجاميع، في الخلية التي الماغنيسيوم، يمكن أن يكون مثقف في التعليق أو في إدارة المحتوى في المؤسسة مثل البروتينات استجواب لآليات الخلية التمايز، غير متماثلة انقسام الخلية والتقيد خلية إلى خلية حركية13،14. فحوصات غزو السماح باختبار العدوانية المتأصلة للورم وتحديد الجزيئات التي تكون بمثابة تشيمواتراكتانتس أثناء عملية الغازية15. نماذج ثلاثية الأبعاد الشاملة، وتمثل تنويع بأسعار معقولة في المختبر الثقافة الخلية التي تعكس على نحو أوثق أنسجة طبيعية والنمطان morphogenesis.
لقد قمنا بتصميم نظام ثقافة المشارك خلية ثلاثية الأبعاد استناداً النماذج المذكورة أعلاه7،10،11، استخدام خطوط الخلية BrC كل البشرية التجارية إمكانات العدوانية المعروفة (أنواع لومينال وسالب الثلاثي) والابتدائية الخلايا اكسبلانتيد من المرضى BrC. ونحن أولاً وضع نموذج مثقف يشترك مع U937 وحيدات في مقتطف مصفوفة خارج الخلية (أكمي) فيها غير العدواني (MCF-7) أو عدوانية BrC (نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231) خلايا-استناداً إلى نظام ثلاثي الأبعاد الذي يسمح بالتفاعل المباشر خلية خلية. واستخدمت هذه الثقافات المشاركة لتحديد كيفية تأثير الاتصال بين هذه الأنساب الخلية اثنين النسخ من مجموعة من الجينات المتصلة بالسرطان السلوك العدواني. ولوحظ زيادة كبيرة في نسخة (كوكس-2) السيكلواوكسيجيناز-2 التي تزامنت مع زيادة إنتاج إحدى منتجاتها، البروستاغلاندين E2 (PGE2)، استنتاجا بأن أبرز دور الالتهاب في تطور السرطان. زيادة النسخ نظام التمثيل التناسبي المختلط لوحظ أيضا أن يرتبط بزيادة الكولاجين بروتيوليسيس عندما كانت شاركت مثقف العدوانية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا مع U937 وحيدات في الثقافات التي تحتوي على الكولاجين دي كيو “الرابع”. من المذكرة، ثقافاتنا المشتركة لا تؤيد الافتراض بأن هناك حاجة إلى آليات التفاعل خلية خلية لتدهور الكولاجين. واقترح بدلاً من ذلك أن الاتصالات بين الأنساب الخلية اثنين وساطة من جزيئات يفرزها. وعلاوة على ذلك، الواردة supernatants تحصد من هذه الاختبارات ثقافة المشارك العوامل القابلة للذوبان التي مشوش acini غدي شكلتها غير تحول الخلايا MCF-10A13. وقد وجد أن العدوانية والابتدائي BrC الخلايا يفرز مستويات الجزيئات chemotactic الوحيدات العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1، GM-CSF، ورنتيس مرتفعة. وهكذا، أوضحنا ثقافة ثلاثية الأبعاد التي تم فصل الخلايا في خلية يدخل الثقافة لمنع التفاعلات خلية خلية. واستخدمت هذه الثقافات لمعالجة الاتصالات غير المباشرة بين الخلايا BrC ووحيدات. لهذه الاختبارات وغير عدوانية وعدوانية من خطوط الخلايا BrC التجارية والابتدائي BrC الخلايا وثلاثة أنواع مختلفة من وحيدات البشرية: خلايا U937 و THP-1 التجارية ووحيدات الأولية (PMs) المعزولة من الدم المحيطي صحية من الجهات المانحة (جميع واستخدمت وحيدات في حالة عدم تنشيط) استخدمت. ولوحظت زيادة تركيزات السيتوكينات الالتهابية 1β إيل وايل-8 إثراء الثقافة المشتركة. وبالمثل، وجد أن MMP-1 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-2 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-10 وزيدت أيضا في BrC خلايا الوحيدات الثقافات المشتركة، ومن ثم يعزز الاستنتاجات السابقة14. ويرد في هذه المخطوطة، سير عمل نقطة بنقطة لعزل الخلايا BrC الأولية واختبار في الثقافات 3D جنبا إلى جنب مع نتائج تمثيلية. ويشكل هذا العمل مثالاً جيدا للإمكانات الكبيرة التي توفر في المختبر نظم خلية ثلاثية الأبعاد استجواب جوانب محددة من الأحياء الورم.
Protocol
Representative Results
Discussion
تنمو الخلايا الظهارية في تكيف ثلاثية الأبعاد مكانية وتفاعلها مع بروتينات ECM المحوري للتوازن الأنسجة. دراسات السرطان كثيرة تستند إلى خلايا تزرع في مونولاييرس (2D) وعلى الرغم من أنها كانت حاسمة بالنسبة لفهم جوانب عديدة من تشكيل الورم والتقدم، مونولاييرس لا الخص الخصائص التي يفرض إدارة المحت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من مبرزين فونسيك أفريقيا جنوبي الصحراء/الضمان الاجتماعي/عمال المشروع رقم 233061 إلى ازكويل م فوينتس-Pananá وفوندو دي الدعم على غرار الدراسات، مستشفى الأطفال في المكسيك فريدريكو غوميز (المشروع رقم HIM-2014-053). نا اسبينوزا-سانشيز طالب دكتوراه من Programa de دوكتورادو en Biomédicas العلوم، الجامعة الوطنية المستقلة بالمكسيك (يونام) وتلقت زمالة 231663 من المجلس الوطني. ه-ق “نا”، نعترف أيضا بالدعم المالي المقدم من المعهد المكسيكي “الضمان الاجتماعي” (الضمان الاجتماعي).
Materials
| U937 | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1593.2 | Monocytic cell line/histiocytic lymphoma |
| THP-1 | American Type Culture Collection ATCC | TIB-202 | Monocytic cell line/acute monocytic leukemia |
| MCF-10A | American Type Culture Collection ATCC | CRL-10317 | Non-transformed breast cell line |
| MCF-7 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-22 | Breast Cancer Cell line |
| T47D | American Type Culture Collection ATCC | HTB-133 | Breast Cancer Cell line |
| HS578T | American Type Culture Collection ATCC | HTB-126 | Breast Cancer Cell line |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-26 | Breast Cancer Cell line |
| RPMI 1640 medium | GIBCO BRL Life Technologies | 11875-093 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO BRL Life Technologies | 11964-092 | 4.5 g/L glucose |
| DMEM/F12 | GIBCO BRL Life Technologies | 11039-021 | |
| Antibiotic/Antimycotic | GIBCO BRL Life Technologies | 15240-062 | 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16000-044 | |
| Horse serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16050114 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA 1X | GIBCO BRL Life Technologies | 25300-062 | |
| PBS 1X (Phosphate Buffered Saline | GIBCO BRL Life Technologies | 20012-027 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 (1.00mg) | |
| Insulin | SIGMA-ALDRICH | I1882-100MG | |
| Hydrocortisone | SIGMA-ALDRICH | H088-5G | |
| Cholera toxin Vibrio cholerae | SIGMA-ALDRICH | C8052-1MG | |
| Matrigel | Corning Inc | 356237 | Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| MCP-1 | PeproTech | 300-04 | |
| RANTES | PeproTech | 300-06 | |
| IL-8 | PeproTech | 200-08 | |
| IL-1β | PeproTech | 200-01B | |
| Crystal-violet | Hycel México | 541 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P6148 | |
| Transwell permeable supports (inserts) | Corning Inc | 3422 | 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates |
| Transwell permeable supports (inserts) | Thermofisher Scientific | 140620 | 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates |
| Monocyte Isolation Kit II Human | Miltenyi Biotec | 130-091-153 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay | EMD Millipore | HCYTOMAG-60K | |
| Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) | Luminex Corporation | 40-072 | |
| Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) | Nalge Nunc International | 177402 | |
| Glass bottom microwell 35mm petri dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
References
- Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95 (1), 2-7 (2016).
- Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8 (5), 761-773 (2017).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18 (5), 349-355 (2008).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
- Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3 (9), 785-792 (2001).
- Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2 (3), 159-175 (2003).
- Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, 20 (2008).
- Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505 (2013).
- Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205 (2017).
- Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87 (2012).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, 18 (2008).
- Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, 15 (2004).
- Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163 (2016).
- Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11 (2), 21 (2009).
- Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79 (2012).
- Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
- Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels – Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16 (1), 118-126 (2014).
