Analysere kommunikasjonen mellom monocytter og primære brystkreft celler i en ekstracellulær Matrix ekstrakt (ECME)-basert tredimensjonale System
Summary
Her beskriver vi en tredimensjonal kultur metode for å analysere morfologi av primære brystkreft celler, så vel som å studere deres direkte/indirekte interaksjon med monocytter og resultatene som kollagen fornedrelse, immun celle rekruttering, celle invasjon, og fremme av kreft relatert betennelse.
Abstract
Innebygd i den ekstracellulære matrisen (EFM), kommunisere normal og neoplastic epitelceller nært med blodkreft og ikke-blodkreft cellene, dermed sterkt påvirke normalt vev homeostase og sykdom utfallet. Brystkreft spille tumor-assosiert makrofager (TAMs) en avgjørende rolle i sykdomsprogresjon og metastasering regelmessighet; Det er derfor viktig å kontrollere sykdommen å forstå mekanismene av monocyte chemoattraction svulst microenvironment og deres samhandling med kreftceller. Her gir vi en detaljert beskrivelse av et tredimensjonalt (3D) co kultur system av menneskelige brystkreft (BrC) celler og menneskelige monocytter. BrC celler produsert høye basale nivåer av regulert på-aktivisering, normal T-celle uttrykt og utskilles (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) og granulocytt-macrophage koloni-stimulerende faktor (G-CSF), mens i co kultur med monocytter, Pro-inflammatoriske cytokiner Interleukin (IL) -1 beta (IL-1β) og IL-8 var beriket med matrise metalloproteinases (MMP) -1, MMP-2 og MMP-10. Dette svulst stroma microenvironment fremmet motstand mot anoikis i MCF-10A 3D acini-lignende strukturer, chemoattraction av monocytter og invasjonen av aggressiv BrC celler. Protokollene presenteres her gir et rimelig alternativ for å studere intra-svulst kommunikasjon og er et eksempel på det store potensialet som in vitro 3D celle-systemer for å avhøre funksjoner i svulst biologi relatert til tumor aggresjon.
Introduction
Svulst biologi er langt mer intrikate enn tidligere antatt. Montering bevis viser at kreftceller er mer enn bare bulk av ukontrollert voksende celler. Snarere, forskjellige neoplastic celler synes å utføre forskjellige funksjoner viser høy organisasjon og hierarki innenfor svulst1. Kreftceller er også i intime kommunikasjon med ikke-transformert cellene: makrofager, fibroblaster, lymfocytter, adipocytter, endotelceller, blant andre celler er alle midt i stillaset proteiner og polysakkarider som utgjør ECM. Mange direkte og indirekte samhandling er etablert mellom transformert og ikke-transformert celler og ECM, som utøver en mektig innflytelse over sykdom utfallet2,3. I det konkrete tilfellet av BrC er det spesielt viktig å analysere kommunikasjonen av BrC celler med TAMs, vurderer at TAMs har blitt funnet for å spille en avgjørende rolle i utviklingen av svulsten, øker risikoen for metastasering og for sykdommen tilbakefall4 ,5.
Analysere intra-tumoral vekselsvirkningene og deres mulige utfall, nye 3D i vitro tilnærminger har blitt utviklet basert på bruk av ECM ekstrakter som gir en mye mer komplisert microenvironment, nærmere virkeligheten av svulst biologi, i forhold til de konvensjonelle monolayer cellekulturer der cellene vokse knyttet til plast. Petersen og Bissell6 gitt den første modellen av nonmalignant og ondartet mammary epitelceller kultivert på en laminin-rik kjelleren membran og var først til å beskrive 3D organotypic strukturer som diskriminerer nonmalignant menneske bryst epitelceller fra sine ondartet kolleger. Et tiår senere, modellen utviklet av Debnath, Muthuswamy, og Brugge7,8,9 gitt et verdifullt verktøy for å belyse de biologiske banene kompromittert under malign transformasjon av kjertel acini, slik som store acini formasjon på grunn av ukontrollerte spredningen, delocalization av tett krysset proteiner som bevis av nedsatt celle polarisering, og tap av acini lumen som følge av cellen motstand mot anoikis, en type programmert celledød som oppstår i Anchorage-avhengige celler når de koble fra omkringliggende ECM. Modeller av Sameni, Jedeszko og Sloane har fokusert på tenkelig proteolytiske av celler, som er nært knyttet til invasiveness, en annen viktig egenskap svulst malignitet10,11,12. Disse modellene er avhengige av protein matriser blandet med annet fluorescens-slukket protein underlag (DQ-gelatin, DQ-kollagen I, og DQ-kollagen IV), hvilke fluorescerende signaler er indikativ av proteolytisk degradering av kollagen. 3D modeller brukes også stamcelleforskningen egenskaper av både ikke-transformert og kreftceller, i hvilken celle aggregat, også kalt spheroids, kan kultivert i suspensjon eller ECM-lignende proteiner forhører for mekanismer av celledifferensiering, asymmetrisk celledeling, overholdelse av celle til celle, og cellen motilitet13,14. Invasjonen analyser at testing av iboende aggressivitet av svulsten og identifikasjon av molekylene som tjener som chemoattractants under invasiv prosessen15. Samlet, 3D modeller representerer en rimelig diversifisering i vitro celle kultur som nærmere gjenspeile normal og kreftfremkallende vev morphogenesis.
Vi har designet en 3D celle co kultur-systemet basert på de nevnte modeller7,10,11, med både menneskelige kommersielle BrC cellelinjer med kjente aggressiv potensial (luminal og trippel-negativ typer) og primær celler explanted fra BrC pasienter. Vi utviklet en modell der ingen-aggressiv (MCF-7) eller aggressiv (MDA-MB-231) BrC celler var co kulturperler med U937 monocytter i en ekstracellulær matrix ekstrakt (ECME)-basert 3D-system som tillater direkte celle-celle interaksjoner. Disse co kulturer ble brukt til å bestemme hvordan kommunikasjonen mellom disse to cellen overleveringslinjer påvirket transkripsjon av et sett av gener som er knyttet til kreft aggressiv atferd. En betydelig økning av cyclooxygenase-2 (COX-2) avskrift ble observert som falt sammen med en økt produksjon av en av sine produkter, prostaglandin E2 (PGE2), et funn som valgte betennelse i kreft progresjon. Økt transkripsjon av MMP ble også observert som korrelert med større kollagen proteolyse når aggressiv MDA-MB-231 celler var co kultivert med U937 monocytter i DQ-kollagen IV inneholder kulturer. Av notatet støtter våre co kulturer ikke antakelsen om at celle-celle samhandling mekanismer er nødvendig til kollagen fornedrelse. Det foreslo heller at kommunikasjon mellom to cellen linjen ble formidlet av utskilles molekyler. Videre inneholdt supernatants høstet fra disse co kultur analyser løselig faktorer som uorganisert kjertel acini dannet av ikke-transformert MCF-10A celler13. Det ble funnet at aggressiv og primære BrC celler utskilles forhøyede nivåer av monocyte chemotactic molekyler MCP-1, GM-CSF og RANTES. Derfor skissert vi en 3D kultur der celler ble skilt i celle kultur setter å hindre celle-celle interaksjoner. Disse kulturene ble brukt til å løse indirekte kommunikasjonen mellom BrC celler og monocytter. For disse analyser, ingen-aggressiv og aggressiv reklamen BrC cellelinjer og primære BrC celler og tre typer menneskelig monocytter: kommersielle U937 og THP-1 celler og primære monocytter (PMs) isolert fra perifert blod sunn givere (alle monocytter ble brukt i en ingen-aktivert begrunne) ble brukt. Økte konsentrasjoner av inflammatoriske cytokiner IL 1β og IL-8 ble observert å være beriket i co kultur. På samme måte ble det funnet at MMP-1, MMP-2 og MMP-10 også økt i BrC celler-monocytt co kulturer og dermed forsterkende tidligere funn14. I dette manuskriptet er en punkt-til-punkt arbeidsflyt primære BrC celler isolasjon og testing i 3D kulturer presentert sammen med representant resultater. Dette arbeidet er et godt eksempel på det store potensialet som in vitro 3D celle-systemer for å avhøre bestemte aspekter av svulst biologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epitelceller vokse i en 3D romlige konformasjon og deres samspill med ECM proteiner er avgjørende for vev homeostase. Mange kreft studier har vært basert på celler dyrket i monolayers (2D) og selv om de har vært avgjørende for å forstå mange aspekter av tumor formasjon og progresjon, monolayers er recapitulate ikke kjennetegnene som ECM pålegger celler, for forekomst: begrense spredning, vedheft-avhengig celle overlevelse, apikale-basolateral polaritet, ECM remodeling, celledifferensiering, osv. Viktiger…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE prosjektet nr. 233061 til Ezequiel M. Fuentes-Pananá og Fondo de Apoyo a la Investigación, sykehuset Infantil de México Federico Gómez (prosjektnummeret HIM-2014-053). Espinoza-Sánchez NA er en doktorgrad student fra Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) og mottatt fellesskap 231663 fra CONACYT. E-S NA, erkjenner også økonomisk støtte fra den meksikanske Institute for Social Security (IMSS).
Materials
| U937 | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1593.2 | Monocytic cell line/histiocytic lymphoma |
| THP-1 | American Type Culture Collection ATCC | TIB-202 | Monocytic cell line/acute monocytic leukemia |
| MCF-10A | American Type Culture Collection ATCC | CRL-10317 | Non-transformed breast cell line |
| MCF-7 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-22 | Breast Cancer Cell line |
| T47D | American Type Culture Collection ATCC | HTB-133 | Breast Cancer Cell line |
| HS578T | American Type Culture Collection ATCC | HTB-126 | Breast Cancer Cell line |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-26 | Breast Cancer Cell line |
| RPMI 1640 medium | GIBCO BRL Life Technologies | 11875-093 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO BRL Life Technologies | 11964-092 | 4.5 g/L glucose |
| DMEM/F12 | GIBCO BRL Life Technologies | 11039-021 | |
| Antibiotic/Antimycotic | GIBCO BRL Life Technologies | 15240-062 | 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16000-044 | |
| Horse serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16050114 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA 1X | GIBCO BRL Life Technologies | 25300-062 | |
| PBS 1X (Phosphate Buffered Saline | GIBCO BRL Life Technologies | 20012-027 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 (1.00mg) | |
| Insulin | SIGMA-ALDRICH | I1882-100MG | |
| Hydrocortisone | SIGMA-ALDRICH | H088-5G | |
| Cholera toxin Vibrio cholerae | SIGMA-ALDRICH | C8052-1MG | |
| Matrigel | Corning Inc | 356237 | Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| MCP-1 | PeproTech | 300-04 | |
| RANTES | PeproTech | 300-06 | |
| IL-8 | PeproTech | 200-08 | |
| IL-1β | PeproTech | 200-01B | |
| Crystal-violet | Hycel México | 541 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P6148 | |
| Transwell permeable supports (inserts) | Corning Inc | 3422 | 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates |
| Transwell permeable supports (inserts) | Thermofisher Scientific | 140620 | 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates |
| Monocyte Isolation Kit II Human | Miltenyi Biotec | 130-091-153 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay | EMD Millipore | HCYTOMAG-60K | |
| Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) | Luminex Corporation | 40-072 | |
| Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) | Nalge Nunc International | 177402 | |
| Glass bottom microwell 35mm petri dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
References
- Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95 (1), 2-7 (2016).
- Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8 (5), 761-773 (2017).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18 (5), 349-355 (2008).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
- Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3 (9), 785-792 (2001).
- Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2 (3), 159-175 (2003).
- Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
- Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, 20 (2008).
- Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505 (2013).
- Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205 (2017).
- Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87 (2012).
- Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, 18 (2008).
- Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, 15 (2004).
- Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163 (2016).
- Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11 (2), 21 (2009).
- Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79 (2012).
- Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
- Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels – Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92 (2015).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16 (1), 118-126 (2014).
