Análisis de la comunicación entre monocitos y las células de cáncer de mama primario en una matriz extracelular extracto (ECME)-sistema tridimensional basado en
Summary
Aquí, describimos un método de cultivo tridimensional para analizar la morfología de primario de mama las células cancerosas, así como para estudiar sus interacciones directa e indirecta con los monocitos y los resultados tales como la degradación de colágeno, reclutamiento de células inmunes de la célula invasión y la promoción de la inflamación relacionada con el cáncer.
Abstract
Incrustado en la matriz extracelular (MEC), células epiteliales normales y neoplásicas comunican íntimamente con las células hematopoyéticas y no hematopoyéticas, así influir en gran medida resultado de homeostasis y enfermedad de tejido normal. En el cáncer de mama, los macrófagos asociados a tumor (TAMs) juegan un papel crítico en la progresión de la enfermedad, metástasis y recurrencia; por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de monocito chemoattraction el microambiente del tumor y sus interacciones con las células del tumor es importante para controlar la enfermedad. Aquí, ofrecemos una descripción detallada de un sistema tridimensional (3D) de cocultivo de células de mama cancerosas (BrC) y monocitos humanos. BrC células producen altos niveles basales de la regulada en la activación, célula T normal expresado y secretado (RANTES), monocito chemoattractant protein-1 (MCP-1) y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (G-CSF), mientras que en co-cultivo con monocitos, citoquinas proinflamatorias interleucina (IL) -1 beta (IL-1β) y IL-8 se enriquecieron con metaloproteinasas de matriz (MMP) -1, MMP-2 y MMP-10. Este microambiente del tejido conectador tumoral promovido resistencia a anoikis en MCF-10A 3D acinos-como las estructuras, chemoattraction de monocitos y la invasión de células agresivas de BrC. Los protocolos aquí presentados proporcionan una alternativa asequible para estudiar la comunicación intra-tumor y son un ejemplo del gran potencial que ofrecen sistemas 3D de la célula in vitro para interrogar a características específicas de la biología del tumor relacionado con tumor agresión.
Introduction
Biología del tumor es mucho más intrincado que pensó previamente. Creciente evidencia muestra que las células tumorales son más que un simple bulto de células proliferación incontroladas; por el contrario, diferentes células neoplásicas parecen realizar diferentes funciones mostrando la alta organización y jerarquía en el tumor1. Las células del tumor están también en íntima comunicación con las células no transformadas: macrófagos, fibroblastos, linfocitos, adipocitos, células endoteliales, entre otras células están todos inmersos en el andamio proteínas y polisacáridos que constituyen el ECM. Numerosas interacciones directas e indirectas se establecen entre las células transformadas y no transformadas y con el ECM, que ejerce una poderosa influencia sobre la enfermedad resultado2,3. En el caso específico de BrC, es particularmente importante disecar la comunicación de las células de BrC con TAMs, teniendo en cuenta que se ha encontrado TAMs que juegan un papel crítico en la evolución del tumor, aumentando el riesgo de metástasis y recidiva de la enfermedad4 ,5.
Para analizar las interacciones intra tumoral y sus posibles resultados, nuevo 3D en vitro se han desarrollado en base a la utilización de extractos de ECM que proporcionan un microambiente mucho más complejo, más cercano a la realidad de la biología del tumor, en comparación a las culturas de célula monocapa convencional en el cual las células crecen pegadas al plástico. Petersen y Bissell6 proporciona el primer modelo de no malignas y células epiteliales mamarias malignas cultivan sobre una membrana basal de rico en laminina y fueron los primeros en describir las estructuras 3D organotypic que discriminan no malignas humanos células epiteliales de la mama de sus homólogos malignos. Una década más tarde, el modelo desarrollado por el Debnath, Muthuswamy, y Brujas7,8,9 proporciona una herramienta valiosa para aclarar las vías biológicas durante la transformación maligna de los acinos glandulares, tal como formación de acinos grande debido a la proliferación incontrolada, deslocalización de las proteínas de la ensambladura apretada como evidencia de la polarización celular deteriorada y la pérdida del lumen de los acinos como resultado de la resistencia celular a la anoikis, un tipo de muerte celular programada ocurre en células dependientes de anclaje cuando se separan del ECM circundante. Los modelos de Sameni, Jedeszko y Sloane se han centrado en imágenes actividad proteolítica por células, que está estrechamente relacionada con la invasividad, otro rasgo fundamental de la malignidad de tumor10,11,12. Estos modelos se basan en las matrices de proteína mezclados con los substratos de la proteína de fluorescencia apaga diferentes (gelatina de DQ, DQ-colágeno I y DQ-colágeno IV), en que las señales fluorescentes son indicativos de la degradación proteolítica de colágeno. Modelos 3D se utilizan también para estudiar propiedades de la célula de vástago de ambos no transformado y las células del tumor, en que celda agregados, también llamados esferoides, pueden ser cultivados en suspensión o en proteínas ECM como interrogando por mecanismos de diferenciación celular, asimétrica división celular, adhesión de célula a célula y célula motilidad13,14. Ensayos de invasión que la prueba de la agresividad intrínseca del tumor y la identificación de las moléculas que sirven como atrayentes durante el proceso invasor15. En generales, 3D modelos representan una diversificación asequible de en vitro cultivo celular que reflejan más de cerca la morfogénesis normal y oncogénicos de los tejidos.
Hemos diseñado un sistema de cocultivo celular 3D basado en los modelos antes mencionados7,10,11, utilizando ambos humanas líneas celulares BrC comerciales de conocido potencial agresivo (tipos luminales y triple negativo) y primaria células explantadas de pacientes de BrC. En primer lugar se desarrolló un modelo donde no agresivos (MCF-7) o agresivos (MDA-MB-231) BrC las células fueron cultivadas conjuntamente con U937 monocitos en un extracto de la matriz extracelular (ECME)-sistema basado en 3D que permite las interacciones célula-célula directa. Estas culturas Co fueron utilizadas para determinar cómo la comunicación entre estos linajes dos celulares influyó en la transcripción de un conjunto de genes relacionados con la conducta agresiva de cáncer. Se observó un aumento significativo de ciclooxigenasa-2 (COX-2) transcripción que coincidió con un aumento de la producción de uno de sus productos, prostaglandina E2 (PGE2), un hallazgo que puso de relieve el papel de la inflamación en la progresión del cáncer. Mayor transcripción de MMP también observó que correlaciona con una mayor proteólisis de colágeno cuando agresivo células MDA-MB-231 fueron cultivadas conjuntamente con U937 monocitos en culturas que contiene DQ-colágeno IV. De nota, nuestros co-cultivos no apoya el supuesto de que los mecanismos de interacción célula-célula son necesarias para la degradación de colágeno. Más bien, sugirió que la comunicación entre los linajes de dos células fue mediada por moléculas segregadas. Además, los sobrenadantes de estos ensayos de co-cultivo contienen factores solubles que desorganizan acinos glandulares formados por las células no transformadas MCF-10A13. Se constató que de agresivo y las células primarias de BrC secretadas niveles elevan de moléculas quimiotáctica de monocitos MCP-1, GM-CSF y RANTES. Por lo tanto, delineamos una cultura 3D en el que las células fueron separadas en célula cultura insertos para evitar las interacciones célula-célula. Estas culturas fueron utilizadas para abordar la comunicación indirecta entre monocitos y las células de la BrC. Para estos ensayos, no agresivos y agresivas comercial BrC las líneas celulares y las células primarias de BrC y tres tipos diferentes de monocitos humanos: las células U937 y THP-1 comerciales y primarios monocitos (PMs) aisladas de sangre periférica de donantes sanos (todos monocitos se utilizaron en un estado desactivado) fueron utilizados. Aumento de las concentraciones de citoquinas inflamatorias IL-1β y IL-8 fueron observado para ser enriquecido en co-cultivo. Asimismo, se encontró que MMP-1, MMP-2 y MMP-10 también se incrementaron en el BrC co-cultivos de células monocitos y así refuerzo anterior resultados14. En este manuscrito, se presenta un flujo de trabajo punto por punto de aislamiento primario de las células de BrC y pruebas en 3D culturas junto con resultados representativos. Este trabajo constituye un buen ejemplo del gran potencial que ofrecen sistemas 3D de la célula in vitro para interrogar aspectos específicos de la biología del tumor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las células epiteliales crecen en una conformación espacial 3D y su interacción con las proteínas de la ECM es fundamental para la homeostasis del tejido. Se han basado muchos estudios de cáncer en las células cultivadas en monocapas (2D) y aunque han sido fundamentales para entender muchos aspectos de la formación del tumor y la progresión, monocapas no recapitular las características que impone el ECM en las células, para ejemplo: limitación de la proliferación, supervivencia dependiente de la adhesión cel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE proyecto Nº 233061 a Ezequiel M. Fuentes-etorno y Fondo de Apoyo a la Investigación, Hospital Infantil de México Federico Gómez (proyecto número HIM-2014-053). NA de Espinoza Sánchez es estudiante de doctorado del Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) y recibió beca 231663 de CONACYT. E S NA, también reconoce el apoyo financiero proporcionado por el Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS).
Materials
| U937 | American Type Culture Collection ATCC | CRL-1593.2 | Monocytic cell line/histiocytic lymphoma |
| THP-1 | American Type Culture Collection ATCC | TIB-202 | Monocytic cell line/acute monocytic leukemia |
| MCF-10A | American Type Culture Collection ATCC | CRL-10317 | Non-transformed breast cell line |
| MCF-7 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-22 | Breast Cancer Cell line |
| T47D | American Type Culture Collection ATCC | HTB-133 | Breast Cancer Cell line |
| HS578T | American Type Culture Collection ATCC | HTB-126 | Breast Cancer Cell line |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection ATCC | HTB-26 | Breast Cancer Cell line |
| RPMI 1640 medium | GIBCO BRL Life Technologies | 11875-093 | |
| DMEM High Glucose | GIBCO BRL Life Technologies | 11964-092 | 4.5 g/L glucose |
| DMEM/F12 | GIBCO BRL Life Technologies | 11039-021 | |
| Antibiotic/Antimycotic | GIBCO BRL Life Technologies | 15240-062 | 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 0.25 µg/mL Fungizone |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16000-044 | |
| Horse serum | GIBCO BRL Life Technologies | 16050114 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA 1X | GIBCO BRL Life Technologies | 25300-062 | |
| PBS 1X (Phosphate Buffered Saline | GIBCO BRL Life Technologies | 20012-027 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | AF-100-15 (1.00mg) | |
| Insulin | SIGMA-ALDRICH | I1882-100MG | |
| Hydrocortisone | SIGMA-ALDRICH | H088-5G | |
| Cholera toxin Vibrio cholerae | SIGMA-ALDRICH | C8052-1MG | |
| Matrigel | Corning Inc | 356237 | Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma, extracellular matrix extract, Store at -20°C until use at 4°C |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| MCP-1 | PeproTech | 300-04 | |
| RANTES | PeproTech | 300-06 | |
| IL-8 | PeproTech | 200-08 | |
| IL-1β | PeproTech | 200-01B | |
| Crystal-violet | Hycel México | 541 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | P6148 | |
| Transwell permeable supports (inserts) | Corning Inc | 3422 | 6.5 mm diameter, 8 µm pore size/24-well plates |
| Transwell permeable supports (inserts) | Thermofisher Scientific | 140620 | 6.5 mm diameter, 0.4 µm pore size/24-well plates |
| Monocyte Isolation Kit II Human | Miltenyi Biotec | 130-091-153 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Kit 96 Well Plate Assay | EMD Millipore | HCYTOMAG-60K | |
| Magpix with xPonent software (laser based fluorescent analytical test instrumentation) | Luminex Corporation | 40-072 | |
| Lab-Tek chamber slide with cover (8 well) | Nalge Nunc International | 177402 | |
| Glass bottom microwell 35mm petri dishes | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
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