طريقة لتصنيف النصوص في الخلايا الفردية الإشريكيّة القولونية للأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين
Summary
ويصف هذه المخطوطة أسلوب لوصف النصوص الفردية رسول من الحمض النووي الريبي (مرناً) مع تحقيقات الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي، لاستخدامها في الأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين (سمفيش) في كولاي. سمفيش هو أسلوب تصور يسمح الكشف المتزامن، والترجمة، والتقدير الكمي لواحد مرناً الجزيئات في الخلايا الفردية الثابتة.
Abstract
يتم وصف أسلوب لوصف النصوص الفردية رسول من الحمض النووي الريبي (مرناً) في البكتيريا الثابتة للاستخدام في الأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين (سمفيش) في كولاي. يسمح سمفيش قياس التغير خلية إلى خلية في عدد النسخ مرناً للجينات للفائدة، فضلا عن موقع سوبسيلولار للنصوص. الخطوات الرئيسية التي تنطوي عليها هي تثبيت ثقافة الخلية البكتيرية، permeabilization أغشية الخلايا، والتهجين النصوص المستهدفة مع مجموعات من المسابر اليغنوكليوتيد المسمى فلوريسسينتلي القصيرة المتاحة تجارياً. يمكن أن تسمح سمفيش تصوير وقائع جينات متعددة في نفس الخلية، مع القيود التي فرضتها التداخل الطيفي بين علامات مضيئة مختلفة. وعقب انتهاء البروتوكول هو موضح أدناه، خلايا يمكن سهولة تصويرها استخدام مجهر مقترنة بكاميرا مناسبة للأسفار المنخفضة الكثافة. هذه الصور، جنبا إلى جنب مع ملامح الخلية التي تم الحصول عليها من تجزئة المرحلة التباين الإطارات، أو تلطيخ غشاء الخلية، السماح لحساب توزيع مرناً نسخة رقم عينة خلايا باستخدام برمجيات المصدر المفتوح أو كتب مخصصة. يمكن أيضا تطبيق الأسلوب وضع العلامات الموصوفة هنا لنسخ الصورة مع التعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة).
Introduction
ستوتشاستيسيتي هو أحد جوانب الأساسية والتي لا يمكن تجنبها للتعبير الجيني ويؤدي إلى الخلية الخلية التغايرية1، سواء على مستوى النصوص والبروتينات2،3. التحديد الكمي للتفاوت بين الخلايا تحت ظروف محددة جيدا توفر نافذة فريدة من نوعها في العمليات الأساسية التي تكمن وراء التعبير الجيني ولائحته. واحد مصدرا هاما للخلية عدم التجانس في البكتيريا تجري على المستوى النسخي. تتباين أرقام نسخة ليس فقط بسبب ستوتشاستيسيتي للنسخ، ولكن أيضا لعمليات بوستترانسكريبشونال مثل تنظيم الكشف ورناسيس صغيرة2. طريقة واحدة للوصول مباشرة إلى هذا التباين بطريقة كمية علامات النصوص الفردية لجين معين فلوريسسينتلي في سمفيش. هذه المنهجية يسمح بالكشف عن والتعريب سوبسيلولار من جزيئات الحمض النووي الريبي خاصة في ثابتة، الخلايا البكتيرية الفردية4. يتم تهجين مرناس مع مجموعة من المسمى فلوريسسينتلي ~ 20 قاعدة طويلة النوكليوتيد التي تهدف إلى ربط بشكل انتقائي للمحاضر الحرفية للفائدة5،6. العلامات متعددة تضمن الكشف أعلاه الخلفية الفلورية، والفرد مرناً الجزيئات تظهر كبقع حيود محدودة تحت مجهر الأسفار7 (انظر الشكل 1). وهناك نهج أخرى لوصف جزيئات مرناً، التي تحمل تحقيقات تكميلية oligomer haptens مترافق (مثلاً، البيوتين أو ديجوكسيجينين) التي تم الكشف عنها باستخدام تقنيات مراسل الثانوي المسمى فلوريسسينتلي8.
وهناك أساليب أخرى توفر معلومات كمية عن النصوص، بالإضافة إلى سمفيش. بعضها، مثل الشمالي لطخة أو PCR الكمي، التحقيق الجزء الأكبر وهكذا يمكن قياس عدد نسخ مرناً لا موقفهم في الخلايا الفردية. ولهذه الأساليب ليست مناسبة لقياس التغير خلية إلى خلية. تم تطوير تقنية المستندة إلى الصورة الأخيرة التي تسمح للتقدير الكمي لعدد نسخ الكشف داخل الخلايا، فضلا عن موقعها داخل الخلايا، ودعا متعدد الأسفار خطأ قوية في الموقع التهجين (ميرفيش). ميرفيش يستند تعيين رمز شريطي فريد يتألف من مجموعة محددة من عدد محدد من المسابر اليغنوكليوتيد المسمى فلوريسسينتلي. يتم قراءة هذه الرموز الشريطية في جولات متتابعة من القياسات سمفيش، مع فوتوبليتشينج بعد كل جولة من التهجين، وبالتالي زيادة الإنتاجية بأوامر اثنين من حجم9،10. يتطلب هذا الأسلوب سائل الآلي التعامل مع النظام والتصميم السليم لمجموعة التحقيق.
يتيح الجمع بين عدة fluorescence تسمية النصوص الفردية، جنبا إلى جنب مع تقنيات رواية القرار عظمى مثل التعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة)11، بزيادة عشرة إضعاف في القرار في سوبسيلولار ترجمة النصوص. في العاصفة، يسمح مزيج مناسب من المسابر الفلورسنت والمخزن المؤقت للتصوير لدورات متعددة من انبعاث الأسفار كل جزيء مسبار (وامض). كما يمكن استخدام العاصفة صورة الترنسكربيتوم كولاي ومراقبة منظمة الجينوم المنظومة المكانية من الجيش الملكي النيبالي، بوسم جميع وقائع الفائدة12في وقت واحد.
تستند كافة الأساليب وحيدة الخلية التي تم استعراضها أعلاه التصوير المحاضر في الخلايا الثابتة. ومن ثم فإنها لا توفر أية معلومات تتعلق بالخصائص الحركية للنصوص داخل الخلايا. متابعة المحاضر في الخلايا الحية13، يمكن أن تعتبرها مرناس انصهار الجينات التي تهم مجموعة من مواقع الربط. هذه الأخيرة هي ثم يقرها بروتين الحمض النووي الريبي ملزمة، مثل عاثية MS2 معطف البروتين، الذي هو تنصهر فيها بروتين فلوري مثل البروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء)10،،من1415.
هنا يصف لنا طريقة لوسم مرناس الفردية مع مجموعة من المجسات الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي، لاستخدامها في التجارب سمفيش، ولا سيما في كولاي. وعلاوة على ذلك، نحن تظهر أنه يمكن استخدام نفس نظام وضع العلامات للقياسات العاصفة مع تعديلات طفيفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد قمنا بقياس في المختبر عدد نسخة من جينات مختلفة في الخلايا كولاي باستخدام الأسلوب سمفيش2. باختصار، هذا الإجراء يتكون من الخطوات التالية: تثبيت الخلية، permeabilization الأغشية للسماح لاختراق التحقيق، التحقيق في التهجين، وعينه التصوير باستخدام مجهر الأسفار قياسية. ويستند هذ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل منحة من “مؤسسة العلوم إسرائيل” 514415 (إلى ج. س.) وقوات أمن الحدود الهندية-جبهة الخلاص الوطني (المجلس) منحة 2016707 (ج. س.). دعم من سيغفريد وأولمان إيرما كرسي الأساتذة (إلى ج. س.) من المسلم به أيضا.
Materials
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker – Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen – Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 – 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 – 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24×60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX – ET545/30X; EM – ET620/60M; BS – T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX – ET640/30X; EM – ET690/50M; BS – T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa | |||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa |
References
- Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601 (2014).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
- van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523 (2016).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), (2010).
- Skinner, S. O., La Sepúlveda, ., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628 (2014).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
- van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
- Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
- Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence “Turn-On” Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
- Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), (2008).
- So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
- Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
- Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8 (2006).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).
