Método para el etiquetado de las transcripciones en los Escherichia coli las células para una sola molécula de la fluorescencia In Situ hibridación experimentos
Summary
Este manuscrito describe un método para etiquetar las transcripciones de los ARN mensajero (ARNm) con sonda de ADN marcada con fluorescencia, para el uso en experimentos de fluorescencia de una sola molécula en situ hibridación (smFISH) en e. coli. smFISH es un método de visualización que permite la detección simultánea, localización y cuantificación de moléculas individuales de ARNm en células individuales fijas.
Abstract
Se describe un método para etiquetar las transcripciones de los ARN mensajero (ARNm) en bacterias fijadas para uso en experimentos de fluorescencia de una sola molécula en situ hibridación (smFISH) en e. coli. smFISH permite la medición de la variabilidad de la célula a célula en número de copias de ARNm de genes de interés, así como la localización subcelular de las transcripciones. Los pasos principales son la fijación de la cultura de la célula bacteriana, permeabilización de las membranas celulares e hibridación de las transcripciones de destino con juegos de sondas de oligonucleótidos de marcada con fluorescencia corto disponible en el mercado. smFISH permite la proyección de imagen de los transcritos de genes múltiples en la misma celda, con las limitaciones impuestas por el solapamiento espectral entre diferentes marcadores fluorescentes. Después de completar el protocolo que se ilustra a continuación, las células pueden ser fácilmente reflejadas utilizando un microscopio juntado con una cámara adecuada para baja intensidad de la fluorescencia. Estas imágenes, junto con contornos celulares obtenidos de segmentación de los marcos de contraste de fase o de coloración de la membrana de la célula, permiten el cálculo de la distribución número de copia de ARNm de una muestra de las células utilizando el software de la abrir-fuente o medida. El método de etiquetado descrito aquí puede aplicarse también a las transcripciones de la imagen con microscopía óptica estocástica de la reconstrucción (tormenta).
Introduction
La estocasticidad es un aspecto fundamental e inevitable de la expresión génica y da lugar a la célula heterogeneidad1, tanto a nivel de transcripción y proteínas2,3. Cuantificación de la variabilidad entre las células bajo condiciones bien definidas ofrece una ventana única en los procesos básicos que subyacen a su regulación y expresión génica. Una fuente importante de heterogeneidad de la célula en bacterias ocurre a nivel transcripcional. Transcripción de números varían no sólo por la estocasticidad de transcripción, sino también a procesos regulación postranscripcional de small RNAs y ARNases2. Una forma de acceder directamente a esta heterogeneidad de manera cuantitativa es etiquetado fluorescente individual transcripción de un gen determinado en smFISH. Esta metodología permite la detección y la localización subcelular de las moléculas de ARN particular en fijos, las células bacterianas individuales4. mRNAs se hibridó con un sistema de marcada con fluorescencia ~ 20 largo base de oligonucleótidos que son diseñado para unirse selectivamente a las transcripciones de interés5,6. Etiquetado múltiples asegura la detección por fluorescencia del fondo encima de, y las moléculas de ARNm individuales aparecen como manchas de difracción limitada bajo un microscopio de fluorescencia7 (Ver figura 1). Existen otros enfoques para el etiquetado de las moléculas de mRNA, en los que las sondas complementarias oligómero llevan haptenos conjugados (por ejemplo, biotina o digoxigenina) que se detectan mediante técnicas de reportero marcada con fluorescencia secundaria8.
Hay otros métodos que proporcionan información cuantitativa sobre las transcripciones, además de smFISH. Algunos, como el Northern blot o PCR cuantitativa, la mayor parte de la sonda y por lo tanto puede medir el número de copias de mRNA ni su posición en las células individuales. Por lo tanto estos métodos no son adecuados para cuantificar la variabilidad de célula a célula. Se ha desarrollado una técnica basada en la imagen reciente que permite cuantificar el número de copias de ARN dentro de las células así como su localización intracelular, llamado multiplexado error robusto en situ hibridación de la fluorescencia (MERFISH). MERFISH se basa en la asignación de un código de barras único que consiste en una combinación definida de un número fijo de sondas de oligonucleótidos marcados con fluorescencia. Estos códigos de barras se leen hacia fuera en rondas secuenciales de medidas smFISH, con fotoblanqueo después de cada ronda de hibridación, aumentando rendimiento de procesamiento por dos órdenes de magnitud9,10. Esta técnica requiere un líquido automatizado manejo de sistema y el diseño apropiado de la serie de la sonda.
La combinación de múltiples fluorescencia de etiquetado de expedientes individuales, junto con técnicas de superresolución novela como estocásticos reconstrucción óptica microscopia (tormenta)11, permite un aumento diez veces de resolución en el localización subcelular de las transcripciones. En la tormenta, una conveniente combinación de sondas fluorescentes y búfer de imagen permite múltiples ciclos de emisión de fluorescencia por la molécula de la sonda (parpadeando). TORMENTA también puede utilizarse para el transcriptoma de e. coli de la imagen y observar la organización espacial de todo el genoma de ARN, por etiquetado simultáneamente todas las transcripciones de interés12.
Todos los métodos de la sola célula revisados anteriormente se basan en imágenes transcritos en células fijas. Por lo tanto, no proporcionan ninguna información sobre las propiedades cinéticas de las transcripciones dentro de las células. Para seguir las transcripciones en células vivas13, mRNAs pueden ser etiquetados por la fusión del gen de interés para una amplia gama de sitios de Unión. Estos últimos son luego reconocidos por una proteína de unión a RNA, como el bacteriófago MS2 proteína de la cápsida, que está unida a una proteína fluorescente como la proteína verde fluorescente (GFP)10,14,15.
Aquí se describe un método para etiquetar mRNAs individuales con un conjunto de sondas de ADN marcada con fluorescencia, para el uso en experimentos de smFISH, en particular en e. coli. Por otra parte, nos muestran que el mismo esquema de etiquetado puede utilizarse para mediciones de tormenta con modificaciones menores.
Protocol
Representative Results
Discussion
En nuestro laboratorio hemos medido el número de transcripción de distintos genes en células de e. coli utilizando el método de smFISH2. En Resumen, este procedimiento consta de los siguientes pasos: fijación de la célula, permeabilización de membranas para permitir la penetración de la sonda, sonda de hibridación y proyección de imagen usando un microscopio estándar de fluorescencia de la muestra. Este procedimiento se basa en los previamente publicados con algunas modificacio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación de Ciencias de Israel 514415 (a J.S.) y una donación de BSF-NSF (MCB) 2016707 (a J.S.). Apoyo de un Siegfried y Ullman Irma profesor silla (J.S.) también es reconocida.
Materials
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker – Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen – Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 – 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 – 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24×60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX – ET545/30X; EM – ET620/60M; BS – T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX – ET640/30X; EM – ET690/50M; BS – T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
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| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
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References
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