Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi
Summary
Bu el yazması ile DNA probları fluorescently etiketli tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar etiketleme yöntemi açıklar. smFISH eş zamanlı algılama, Yerelleştirme ve miktar tek mRNA molekülleri sabit tek tek hücreleri içinde izin veren bir görselleştirme yöntemidir.
Abstract
Bir yöntem bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için sabit bakterilerde etiketleme için tanımlanır. smFISH mRNA kopya numarası ilgi genlerin hücre hücre değişkenlik ölçümü transkriptleri hücre altı konumunu sağlar. Ana adımları bakteriyel hücre kültürü fiksasyonu, hücre zarları permeabilization ve hedef transkript hibridizasyon setleri ile piyasada kısa Oligonükleotid fluorescently etiketli probları vardır. smFISH farklı floresan işaretleri arasında spektral örtüşme tarafından uygulanan sınırlamaları ile aynı hücrede birden çok gen transkript görüntüleme izin verebilirsiniz. Aşağıda resimli Protokolü tamamlanmasını takiben, hücreleri kolayca düşük yoğunluktaki floresan için uygun bir fotoğraf makinesi ile birleştiğinde bir mikroskop kullanarak yansıması. Bu görüntüler, segmentasyon faz kontrast kare veya hücre zarı boyama, elde edilen hücre dağılımları ile birlikte mRNA kopya numarası dağıtım örneği açık kaynak veya özel olarak yazılmış yazılım kullanarak hücre hesaplama sağlar. Burada açıklanan etiketleme yöntemi Ayrıca resmi transkript Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına) ile uygulanabilir.
Introduction
Stochasticity gen ifadesinin temel ve kaçınılmaz bir unsuru ve hücre-hücre heterojenite1, transkriptler ve proteinler2,3düzeyinde hem de açmaktadır. İyi tanımlanmış koşullar altında hücreler arasında değişkenlik miktarının benzersiz bir pencere gen ekspresyonu ve onun yönetmelik altında yatan temel işlemleri halinde sunmaktadır. Bakterilerde hücre-hücre heterojen bir önemli kaynağı transkripsiyon düzeyinde gerçekleşir. Transkript numaraları sadece stochasticity transkripsiyonu, aynı zamanda düzenleme gibi çoğu işlemleri nedeniyle küçük RNA’ların ve RNAases2tarafından değişir. Doğrudan erişim Bu heterojenlik nicel bir moda bir fluorescently smFISH içinde belirli bir gen bireysel Tutanaklar etiketleyerek yoludur. Bu metodoloji algılama ve belirli RNA molekülleri, hücre altı yerelleştirme sabit, bireysel bakteri hücreleri4sağlar. mRNA’ların seçmeli olarak faiz5,6transkript bağlamak için tasarlanmış fluorescently etiketli ~ 20 Bankası-uzun oligonucleotides bir dizi melezleşmiştir. Birden çok etiket yukarıda arka plan Floresans algılama sağlar ve bireysel mRNA molekülleri kırınım-sınırlı noktalar bir floresan mikroskop altında7 (bkz: şekil 1) olarak görünür. MRNA molekülleri, tamamlayıcı oligomer probları ikincil fluorescently etiketli muhabir teknikleri8kullanarak algılanır konjuge anhidridler (örneğin, biotin veya digoxigenin) taşımak etiketleme için diğer yaklaşım vardır.
Tutanaklar, ek olarak smFISH hakkında kantitatif bilgi başka yöntemleri de vardır. Kuzey gibi bazı leke veya kantitatif PCR, toplu yoklama ve böylece ne mRNA kopya sayısı ne de tek tek hücreler içindeki konumlarını ölçebilirsiniz. Bu nedenle bu yöntemler hücre hücre değişkenlik ölçmek uygun değildir. Hata-sağlam Floresans in situ hibridizasyon (MERFISH) hem RNA’ların kopya numarası hücrelerindeki hem de denilen hücre içi konumlarını miktar multiplexed için izin veren bir son görüntü tabanlı teknik geliştirilmiştir. MERFISH tanımlanmış bir arada sabit sayıda Oligonükleotid fluorescently etiketli sonda gelen oluşan benzersiz bir barkod atama temel alır. Bu barkodları smFISH ölçümleri sıralı tur olarak okunduğu, photobleaching ile hibridizasyon, böylece artan işlem hacmi iki büyüklük9,10tarafından aşağıdaki her yuvarlak. Bu teknik bir otomatik akışkan sistemi ve sonda kümesinin uygun tasarım gerektirir.
Birden çok floresan Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)11gibi roman süper çözümleme teknikleri ile birlikte bireysel transkript etiketlerine göre ile birlikte çözünürlükte panolarında bir artış sağlar transkript hücre altı lokalizasyonu. FIRTINADA, Floresans emisyon (yanıp sönen) prob molekül başına birden fazla döngüleri için uygun kombinasyonu floresan problar ve görüntüleme arabellek sağlar. Fırtına da E. coli transcriptome görüntü ve aynı anda transkriptlerinizin faiz12etiketleme tarafından RNA, genom çapında mekansal organizasyonu gözlemlemek için kullanılabilir.
Yukarıda gözden tüm tek hücreli yöntemleri sabit hücrelerdeki transkript görüntüleme üzerinde temel alır. Bu nedenle, onlar transkript hücrelerdeki Kinetik özelliklerinin ile ilgili herhangi bir bilgi vermeyin. Transkript canlı hücreleri13izlemek için mRNA’ların ilgi siteleri bağlama, bir dizi gen füzyonu tarafından etiketli. Bu ikinci o zaman bakteriyofaj gibi yeşil flüoresan protein (GFP)10,14,15floresan bir protein için erimiş MS2 kat protein gibi bir RNA-bağlayıcı protein tarafından tanınır.
Burada DNA probları fluorescently etiketli smFISH deneyler, kullanmak için bir dizi bireysel mRNA’ların özellikle E. colietiketleme yöntemi açıklanmaktadır. Ayrıca, aynı etiketleme şeması fırtına ölçümleri ile küçük değişiklikler için kullanılan gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
E. coli hücrelerdeki smFISH yöntem2kullanarak farklı genler transkript sayısı bizim laboratuvar olarak ölçülen var. Kısacası, bu yordamı aşağıdaki adımlardan oluşur: hücre fiksasyon, membranlar sonda penetrasyon için izin vermek için permeabilization sonda hibridizasyon ve örnek bir standart floresan mikroskop kullanarak görüntüleme. Bu yordam önceden yayınlanmış olanlar bazı değişiklikler6,7,</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser bir İsrail Bilim Vakfı Hibe 514415 (js) ve bir BSF-NSF (MCB) hibe 2016707 (js) tarafından desteklenmiştir. Destek Siegfried ve Irma Ullman ne bağlı elektrikli sandalyeye (js) da kabul edilmektedir.
Materials
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Pure Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute | Mallinckrodt Baker – Avantor | 8025.25 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free 20X SSC | Life Technologies/Ambion | AM9763 | |
| RNase-free 10X PBS | Life Technologies/Ambion | AM9625 | |
| TE buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) BioUltra, for molecular biology | Sigma-Aldrich | 93283 | |
| nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | 10977035 | |
| Formaldehyde solution for molecular biology, 36.5-38% in water | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Deionized formamide, nuclease free | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM9342 | |
| E. coli tRNA (ribonucleic acid, transfer type xx from escherichia) | Sigma-Aldrich | R1753-500UN | |
| UltraPure BSA (50mg/ml) | Thermo Fisher Scientific/Ambion | AM2616 | |
| Vanadyl-ribonucleoside complex,VRC, 200 mM | New England Biolab | S1402S | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P4707 | |
| Cysteamine and oxygen | Sigma-Aldrich | 30070 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger, Type VII, 50KU | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C40 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| D-fucose | Sigma-Aldrich | F8150 | |
| Vybrant DiO Cell-Labeling Solution | Life Technologies | V2286 | |
| Agarose,low melting reagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Adhesive silicone isolator 24-2mm Dia. X 1.8 mm depth JTR24R-A2-2.0 | Grace Bio-Labs | JTR24R-A2-2.0 666208 | |
| poly-D-lysine-coated glass bottom Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35GC-1.5-14-C | |
| Super life nitrile powder free examination gloves | Supermax | TC-N-9889 | |
| Brand sterilization incubator tape | Sigma-Aldrich | BR61750 | |
| Microcentrifuge tubes (1.8 ml) | Axygen – Corning Life Sciences | MCT-175C | |
| Falcon round-bottom polypropylene tubes (14 ml) | BD Biosciences | 352059 | |
| Conical-bottom centrifuge polypropylene tubes (50 ml) | Corning | 430828 | |
| Serological pipettes (Corning 5 ml) | Corning Life Sciences | 4051 | |
| Serological pipettes (Corning 10 ml) | Corning Life Sciences | 4488 | |
| Serological pipettes (Corning 25 ml) | Corning Life Sciences | 4251 | |
| Spectrophotometer cuvettes | Sarstedt | 67.742 | |
| RNase-free pipette tips 0.2 – 20 μl | FroggaBio | FT20 | |
| RNase-free pipette tips 10 – 200 μl | Axigene/corning | TF-200 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | FroggaBio | FT1000 | |
| RNase-free pipette tips 100 – 1000 μl | Sorenson | 14200 | |
| Syringe disposile 10 mL needle G-21 | Becton Dickinson, Biosciences | BD-309643 | |
| Minisart 0.2 um Syringe Filter | Sartorius | 16534 K | |
| Nikon instruments microscope type A immersion oil A, 8cc | Nikon | MXA20233 | |
| Microscope slides 76 x26, 3"x1"x1mm | Thermo Fisher Scientific | 421-004ET | |
| #0 coverslip slide 24×60 | Thermo Fisher Scientific/Menzel | BNBB024060A0 | |
| Orbital shaker | M.R.C | TOU-50 | |
| Hot block | M.R.C | ||
| Vortex | Fried Electric Company | G-560-E | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5427R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Portable Pipet-Aid XP2, Pipette Controller | Drummond Scientific Company | 4-000-501-I | |
| OD600 Spectrophotometer for Bacterial Growth Rates DiluPhotometer | Midsci | OD600-10 | |
| iXon X3 EMCCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | |
| Eclipse Ti microscope | Nikon | MEA53100 | |
| CFI plan apochromat DM 100X oil objective lambda PH-3 N.A 1.45 WD 0.13 | Nikon | MRD31905 | |
| Filter set (TRITC/CY3): EX – ET545/30X; EM – ET620/60M; BS – T570LP | Nikon | 49005 | |
| Filter set (CY5): EX – ET640/30X; EM – ET690/50M; BS – T660P | Nikon | 49009 | |
| Nis-elements AR auto reaserch software | Nikon | MQS31000 | |
| STORM microscope | Vutara | SR-200 | |
| NA 1.2 water immersion objective | Olympus | ||
| SRX image acquisition and analysis software | Vutara | ||
| Evolve 512 EMCCD camera | Photometrics | ||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with CAL Fluor® Red 590 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for galK mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa | |||
| Stellaris® FISH Probes, Custom Assay with Quaser Fluor® Red 670 Dye | Biosearch Technologies Inc | SMF-1083-5 | |
| Probe Sequence for sodB mRNA: | |||
| gtgttttttctttcagactc | |||
| tagccaaatgcgttggcaaa | |||
| ctgaatggtgtgagtggcag | |||
| caccaatcaaattcacgcgg | |||
| acgaaaccgtcgttgtagtc | |||
| tgataatcaatcgcgcaggg | |||
| gtggtgcacaactgatcacg | |||
| acgcgaactttacggtcatc | |||
| gctgattttcataatcggct | |||
| gcatcgagggaaaactcgtc | |||
| gttttcatgtgcgacaatgg | |||
| cacgccacgaacgtagttag | |||
| ttacgcagttgcagatgttt | |||
| tccagtgaagcggaagaact | |||
| tgctgcaatacggttccgac | |||
| gtccagcggcagatgataaa | |||
| tgaccgttaagcgcgatttg | |||
| agcctacaaactggttttct | |||
| gcggaaattagctgatccat | |||
| aaggcatgatctttcttgcc | |||
| cagtgagcggcaatcgatca | |||
| tgggcatggaaactgctttg | |||
| gatgatgacgacagccacac | |||
| gggtacgtttgaagttactg | |||
| gtgttgtattcgctgccaac | |||
| ggtttcgcactgttcacgac | |||
| tggctgctggaagaaacgcg | |||
| ttcaatggtgacatcacgca | |||
| catgcgcaacagcgttgaac | |||
| ggcgttttcagtcagtatat | |||
| atacgtttcaggtcgccttg | |||
| tgagactccgccatcaactc | |||
| gaaatcatcgcgcatagagg | |||
| caatttgcggcacggtgatt | |||
| ttgacgatttctaccagagt | |||
| acctttgtcgccaatcacag | |||
| ggatcagcgcgacgatacag | |||
| atattgttcagcgacagctt | |||
| gtctctttaatacctgtttt | |||
| ctccttgtgatggtttacaa |
References
- Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601 (2014).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
- van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523 (2016).
- Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), (2010).
- Skinner, S. O., La Sepúlveda, ., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
- Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628 (2014).
- Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090 (2015).
- van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
- Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
- Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence “Turn-On” Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
- Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
- Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), (2008).
- So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
- Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
- Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8 (2006).
- Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
- Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).
