PET e MRI guiada irradiação de um modelo do rato de Glioblastoma usando um Microdifusora
Summary
No passado, pequena animal irradiação geralmente foi realizada sem a capacidade de direcionar um volume de tumor bem delineados. O objetivo era imitar o tratamento do glioblastoma humano em ratos. Utilizando uma plataforma de irradiação de animais pequenos, realizamos guiada por MRI irradiação conformal 3D com secundário-volume baseados em PET impulsionando em um ajuste pré-clínicos.
Abstract
Há décadas, pesquisa de radiação animal pequeno principalmente foi realizada usando configurações experimentais bastante cruel, aplicando técnicas simples de feixe único sem a capacidade para atingir um volume de tumor específico ou bem delineados. A entrega de radiação foi conseguida usando fontes de radiação fixo ou aceleradores lineares produzindo raios-x megavoltage (MV). Estes dispositivos são incapazes de alcançar precisão sub mm necessário para pequenos animais. Além disso, as altas doses entregue para avaliação saudável de resposta cesto tecido circundante. Para aumentar a tradução entre pequenos estudos animais e humanos, nosso objetivo era imitar o tratamento do glioblastoma humano em um modelo do rato. Para habilitar uma irradiação mais precisa em uma configuração pré-clínicos, recentemente, plataformas de pesquisa guiada por imagem pequeno animal radiação precisão foram desenvolvidas. Semelhante ao planejamento de sistemas humanos, planejando essas micro-irradiators de tratamento baseia-se na tomografia computadorizada (CT). No entanto, baixo contraste de tecidos moles na CT torna muito difícil de localizar alvos em determinados tecidos, como o cérebro. Portanto, incorporando a ressonância magnética (MRI), que tem excelente contraste de tecidos moles em relação ao CT, permitiria uma delimitação mais precisa do alvo para irradiação. Na última década também biológica de imagens técnicas como tomografia por emissão de pósitrons (PET) ganharam interesse para orientação de tratamento de terapia de radiação. PET permite a visualização de , por exemplo, consumo de glicose, transporte de aminoácidos ou hipóxia, presente no tumor. Visando essas peças altamente proliferativas ou rádio-resistente do tumor com uma dose maior poderia dar um benefício de sobrevivência. Esta hipótese levou à introdução de tumor biológico volume (VFC), além do volume de destino bruto convencionais (GTV), volume de destino clínico (CTV) e volume de destino planejado (PTV).
No laboratório de imagem pré-clínicos da Universidade de Ghent, um microdifusora, um pequeno animal de estimação e um animal pequeno 7 T MRI estão disponíveis. O objetivo era incorporar irradiação guiada por MRI e PET-guiada secundário-volume aumentar em um modelo do rato de glioblastoma.
Introduction
Glioma de alto grau é o tumor cerebral maligno mais comum e mais agressivo em adultos com uma sobrevida média de 1 ano apesar de modalidades de tratamento atual. O tratamento padrão inclui máxima ressecção cirúrgica seguida de radioterapia de feixe externo combinado (RT) e temozolomide (TMZ), seguido de manutenção TMZ1,2,3. Desde a introdução do TMZ agora mais de 15 anos atrás, sem melhorias significativas foram feitas no tratamento destes tumores. Portanto, a implementação de novas estratégias terapêuticas é urgente, mas deve primeiro ser investigada em modelos de terapia do câncer animal pequeno (principalmente camundongos e ratos). Modelos de roedores de tumor-rolamento podem ser usados para investigar a eficácia dos protocolos de radiação nova e complexa, possivelmente combinado com outros agentes de tratamento (novo), para avaliar a resposta de radiação ou para investigar agentes de rádio-protetor. Uma grande vantagem da pesquisa pré-clínica radiação é a capacidade de trabalhar em condições experimentais controladas usando grandes coortes, resultando em dados acelerado rendimento devido a menor expectativa de vida de roedores. Os achados pré-clínicos, em seguida, devem ser traduzidos em um ensaio clínico de uma forma muito mais rápida e mais eficiente do que na atual prática4.
Experimentos de radiação de animais pequenos, nas últimas décadas normalmente alcançados usando fontes de radiação fixo a5,6,7, por exemplo, 137Cs e 60Co, isótopos, ou linear aceleradores se destina para uso clínico humano, aplicando um campo único de radiação com raios x MV6,8,9,10,11. No entanto, esses dispositivos não alcançar precisão sub milímetros, que é necessário para pequenos animais12. Além disso, MV radiografias têm características impróprias para irradiar pequenos alvos, tais como um acúmulo de dose na interface ar-tecido na região da entrada do feixe com uma extensão na ordem o animal em si tamanho4,6 ,8,9,10,11. Este último torna bastante desafiador para entregar uma dose uniforme para um tumor, poupando em torno de um cérebro normal tecido4,8,9,10,11. Portanto, não está claro para quais extensão atual estudos realizados com animais ainda são relevantes para a moderna RT prática12. A este respeito, recentemente desenvolvido tridimensional (3D) conformal pequenos animais micro-irradiators são promissores para colmatar o fosso tecnológico entre 3D guiada por imagem RT técnicas avançadas, tais como a terapia de radiação de intensidade modulada (IMRT) ou conformados arcos usados em humanos e atual irradiação animal pequeno4,13. Essas plataformas fazem uso de uma fonte de raios-x de quilovoltagem (kV) para obter penumbras afiadas e para evitar o acúmulo de dose. Essas plataformas incluem uma fase controlado por computador para animal, posicionamento, um kV fonte de raios-x para a imagem e o tratamento de radiação, um assembly de rotacional do pórtico para permitir a entrega de radiação de vários ângulos e um sistema collimating a moldar o feixe de radiação 4. em 2011, um microdifusora foi instalado no laboratório de imagem pré-clínicos da Universidade de Ghent (Figura 1). Este sistema é semelhante à prática de radioterapia humana moderna e permite uma grande variedade de experimentos pré-clínicos, tais como a sinergia de radiação com outras terapias, esquemas de radiação complexo e estudos de impulso guiada por imagem alvo secundário.
Tratamento a planear estas micro-irradiators é baseado em CT, que é equivalente a humana planejamento sistemas14,15. Para a imagem latente de CT, um detector de raios x a bordo é usado em combinação com o tubo de raios-x kV mesmo que é usado durante o tratamento. Imagem latente de CT é usado como permite o posicionamento exato do animal e fornece as informações necessárias para os cálculos de dose de radiação individual através de segmentação. No entanto, devido ao baixo contraste de tecidos moles no CT da imagem latente, tumores no cérebro dos animais pequenos, tais como glioma de alto grau, não podem ser facilmente delineados. A incorporação da imagem de várias modalidades, é necessária para uma delineação de volume alvo exato. Comparado ao CT, MRI fornece vastamente superior contraste de tecidos moles. Isso torna muito mais fácil de visualizar os limites de lesão que resultarão em uma muito melhor delineação do volume alvo, ajudando a melhor irradiar a lesão e evitar tecido, conforme ilustrado no Figura 24, 16. Uma vantagem adicional é que o MRI usa radiação não-ionizante, ao contrário do CT que está utilizando radiação ionizante. As principais desvantagens da RM são os tempos de aquisição relativamente longo e elevados custos operacionais. É importante notar que as ressonâncias não podem ser usadas para cálculos de dose, como eles não fornecem as informações de densidade de elétrons necessária, embora o progresso está sendo feito neste campo, também com o desenvolvimento recente do senhor-LINACS. Como tal, um conjunto de dados combinado CT/RM é o método de escolha para o planejamento da irradiação de glioma maligno, contendo ambas as informações necessárias para o direcionamento (volumes baseado em MRI) e para cálculos de dose (densidade de elétron CT-baseado).
Para diminuir o fosso entre a irradiação de animais pequena e rotina clínica, MRI claramente precisa integrar o fluxo de trabalho do microdifusora, que exigem um registo correcto entre MRI e CT, que está longe de ser trivial. Neste trabalho, o nosso protocolo para MRI guiadas irradiação conformal 3D do F98 glioblastoma em ratos é discutido, que tem sido recentemente publicado17.
Embora incorporando CT e ressonância magnética do fluxo de trabalho do microdifusora é um claro passo em frente na pesquisa de irradiação de animais pequenos, estas técnicas de imagens anatômicas não permite sempre uma definição completa do volume alvo. As alterações patológicas no cérebro no CT e MRI caracterizam-se pelo conteúdo de água aumentado (edema) e o escapamento da barreira hemato – encefálica ou realce de contraste. No entanto, tanto realce de contraste e áreas hipertenso em T2-weighted MRI não são sempre uma medida exata da extensão do tumor.Foram detectadas células tumorais muito além das margens do realce de contraste12. Além disso, nenhuma destas técnicas pode identificar as partes mais agressivas dentro do tumor, que pode ser responsável pela resistência terapêutica e recorrência do tumor. Portanto, informações adicionais de técnicas de imagem moleculares como animal de estimação pode ter um valor acrescentado para RT alvo definição do volume porque estas técnicas permitem visualizar vias biológicas na vivo12,18, 19.
Em 2000, Ling et al introduziu o conceito de volume alvo biológico (BTV) integrando o fluxo de trabalho de radioterapia, levando a que chamaram de radioterapia conformal multidimensional20imagens anatômicas e funcionais. Isto cria a possibilidade de melhorar a dose alvo entregando uma dose não-uniforme a uma região de destino usando, por exemplo, imagens de PET. O mais amplamente utilizado marcador de PET para estadiamento do tumor e para monitorar o tratamento resposta é fluor-18 (18F) rotulado fluorodeoxyglucose (FDG), que visualiza o metabolismo de glicose21. Em câncer de cabeça e pescoço, estudos anteriores mostraram que o uso de 18F-FDG PET levou a uma melhor estimativa do volume real de tumor, conforme definido por espécimes patológicos, em comparação com CT e MRI22. No cérebro primário, tumores, onde o FDG não é útil devido o sinal de fundo muito forte do cérebro normal, aminoácidos, tais como 11C-metionina e, mais recentemente, 18F-fluoroetthyltyrosine (FET), têm sido investigados para GTV delimitação com muitas vezes marcadas diferenças entre aminoácidos PET e MRI-baseado GTVs23. No entanto, sem julgamento em perspectiva, investigar o significado desse achado foi executado ainda. Neste estudo, nós selecionamos o palpador de aminoácidos 18F-FET e o palpador hipóxia 18F-fluoroazomycin-arabinoside (18F-Fernandes). 18 F-FET e 18F-Fernandes foram seleccionados por um aumento da absorção amino-ácido é fortemente correlacionado com a taxa de proliferação em tumores de GB, Considerando que a captação de uma hipóxia PET-tracer está correlacionada com resistência à de radioterapia (quimioterapia)18 , 23. volume sub impulsionando usando o microdifusora foi otimizado, dando uma dose de radiação adicional a uma parte definida pelo PET do F98 GB tumor em ratos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para atingir a precisa irradiação do alvo tumor glioblastoma no cérebro de ratos, orientação de CT on-Board do microdifusora não era suficiente. Tumores cerebrais são dificilmente visíveis devido ao contraste de tecidos moles insuficiente, mesmo se o realce de contraste seria usado. Como tal, MRI precisa ser incluído para permitir a irradiação mais precisa. Usando uma aquisição sequencial do senhor sobre um sistema de T 7 e uma aquisição de TC sobre o microdifusora, de que fomos capazes atingir a dose para…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer a Stichting Luka Hemelaere e Soroptimista Internacional para apoiar este trabalho.
Materials
| GB RAT model | |||
| F98 Glioblastoma cell line | ATCC | CRL-2397 | |
| Fischer F344/Ico crl Rats | Charles River | N/A | http://www.criver.com/products-services/basic-research/find-a-model/fischer-344-rat |
| Micropump system | World Precision Instruments | UMP3 | Micro 4: https://www.wpiinc.com/products/top-products/make-selection-ump3-ultramicropump/#tabs-1 |
| Stereotactic frame | Kopf | 902 | Model 902 Dual Small Animal Stereotaxic frame |
| diamant drill | Velleman | VTHD02 | https://www.velleman.eu/products/view/?id=370450 |
| Bone wax | Aesculap | 1029754 | https://www.aesculapusa.com/products/wound-closure/hemostatic-bone-wax |
| Insulin syringe Microfine | Beckton-Dickinson | 320924 | 1 mL, 29G |
| InfraPhil IR lamp | Philips | HP3616/01 | |
| Ethilon | Ethicon | 662G/662H | FS-2, 4-0, 3/8, 19 mm |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture | |||
| DMEM | Invitrogen | 14040-091 | |
| Penicilline-streptomycine | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-032 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-224 | |
| Falcons | Thermo Scientific | 178883 | 175 cm2 nunclon surface, disposables for cell culture with filter caps |
| Cell freezing medium | Sigma-aldrich | C6164 | Cell Freezing Medium-DMSO, sterile-filtered, suitable for cell culture, endotoxin tested |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal irradiation | |||
| Micro-irradiator | X-strahl | SARRP | |
| software for irradiation | X-strahl | MuriPlan | pre-clinical treatment planning system (PCTPS), version 2.0.5. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal PET | |||
| microPET system possibility 1 | Molecubes | B-Cube | http://www.molecubes.com/b-cube/ |
| microPET system possibility 2 | TriFoil Imaging, Northridge CA | FLEX Triumph II | http://www.trifoilimaging.com |
| PET tracers | In-house made | 18F-FDG, 18F-FET, 18F-FAZA, 18F-Choline | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal MRI | |||
| microMRI system | Bruker Biospin | Pharmascan 70/16 | https://www.bruker.com/products/mr/preclinical-mri/pharmascan/overview.html |
| Dotarem contrast agent | Guerbet | MRI contrast agent, Dotarem 0,5 mmol/ml | |
| rat whole body transmitter coil | Rapid Biomedical | V-HLS-070 | |
| rat brain surface coil | Rapid Biomedical | P-H02LE-070 | |
| Water-based heating unit | Bruker Biospin | MT0125 | |
| 30 G Needle for IV injection | Beckton-Dickinson | 305128 | 30 G |
| PE 10 tubing (60 cm/injection) | Instech laboratories, Inc | BTPE-10 | BTPE-10, polyethylene tubing 0.011 x .024 in (0.28 x 60 mm), non sterile, 30 m (98 ft) spool, Instech laboratories, Inc Plymouth meeting PA USA- (800) 443-4227- http://www.instechlabs.com |
| non-heparinised micro haematocrit capillaries | GMBH | 7493 21 | these capillaries are filled with water to create markers visible on MRI and CT |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| isoflurane: Isoflo | Zoetis | B506 | Anaesthesia |
| ketamine: Ketamidor | Ecuphar | Anaesthesia | |
| xylazine: Sedaxyl | Codifar NV | Anaesthesia | |
| catheter | Terumo | Versatus-W | 26G |
| Temozolomide | Sigma-aldrich | T2577-100MG | chemotherapy |
| DMSO | Sigma-aldrich | 276855-100ML | |
| Insulin syringe Microfine | Beckton-Dickinson | 320924 | 1 mL, 29G |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Image analysis | |||
| PMOD software | PMOD technologies LLC | PFUS (fusion tool) | biomedical image quantification software (BIQS), version 3.405, https://www.pmod.com/web/?portfolio=22-image-processing-pfus |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia-equipment | |||
| Anesthetic movabe unit | ASA LTD | ASA 0039 | ASA LTD, 5 valley road, Keighley, BD21 4LZ |
| Oxygen generator | Veterinary technics Int. | 7F-3 | BDO-Medipass, Ijmuiden |
References
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