Encellede kvantificering af Protein nedbrydning satser for Time-Lapse Fluorescens mikroskopi i vedhængende cellekultur
Summary
Denne protokol beskriver en metode til at bestemme protein halveringstider i enkelt levende vedhængende celler, ved hjælp af pulse mærkning og fluorescens time-lapse billeddannelse af SNAP-tag fusion proteiner.
Abstract
Proteiner er i en dynamisk tilstand af syntese og nedbrydning og deres halveringstider kan justeres under forskellige omstændigheder. Dog, mest almindeligt anvendte metoder til at bestemme protein half-life er enten begrænset til befolkningens gennemsnit fra mængden celler eller kræver brug af protein syntese hæmmere. Denne protokol beskriver en metode til at måle protein halveringstider i enkelt levende vedhængende celler, ved hjælp af SNAP-tag fusion proteiner i kombination med fluorescens time-lapse mikroskopi. Et protein af interesse sammenvoksede til et SNAP-tag kan kovalent bundet af en fluorescerende, celle gennemtrængelig farvestof, der er koblet til en benzylguanine derivat, og henfald af befolkningens mærket protein kan overvåges efter udvaskning af de resterende farvestof. Efterfølgende celle tracking og kvantificering af den integrerede fluorescens intensitet over tid resulterer i en eksponentiel henfald kurven for hvert registrerede celle, giver mulighed for fastsættelse af protein nedbrydningshastigheder i enkelt celler af kurven montering. Denne metode giver et skøn for heterogenitet af halv-liv i en population af dyrkede celler, som ikke kan nemt vurderes ved hjælp af andre metoder. Tilgang præsenteres her gælder for enhver type af kulturperler vedhængende celler, der udtrykker en protein af interesse sammenvoksede til et SNAP-tag. Her bruger vi mus embryonale stamceller (ES) celler dyrkes på E-cadherin-belagt celle kultur plader til at illustrere hvordan enkelt celle nedbrydningen satser af proteiner med en bred vifte af halve liv kan bestemmes.
Introduction
Det er velkendt, at cellulære proteiner undergår omfattende omsætning med syntese og nedbrydning satser er specifik for hver protein og fysiologiske reguleret. Traditionelt, har protein nedbrydning priser været målt ved hjælp af bulk metoder, såsom radioaktivt puls chase analyse, eller som vedrører protein syntese hæmmere såsom cycloheximide1. Mere nylig, stabile isotop mærkning med aminosyrer i cellekultur (SILAC) i kombination med massespektrometri er blevet etableret til at kvantificere protein omsætning på et globalt plan2. Men disse metoder er begrænset af befolkning i gennemsnit, og oplysninger om celle til celle variabilitet er derfor tabt. Derudover ikke kan forbigående ændringer i protein nedbrydning, der er usynkroniserede på tværs af cellen befolkningen identificeres.
Protein halveringstider kan alternativt også bestemmes ved fluorescens-baserede tilgange, hvilket ofte har fordelen at give én celle opløsning. For eksempel, er en photoactivatable grøn fluorescerende proteiner (paGFP) blevet brugt til at bestemme Oct4 halveringstid i den tidlige pattedyr embryo3. En anden metode til at overvåge protein forfald i levende celler er brugen af et SNAP-tag i kombination med fluorescens time-lapse billeddannelse. SNAP-tag er en mutant version af DNA reparation enzym O6– alkylguanine DNA-alkyltransferase (AGT), der specifikt reagerer med benzylguanine (BG) derivater, som kan være koblet til molekylære sonder4,5, 6. derfor et SNAP-tag fusion protein irreversibelt kan mærkes med et fluorescerende, celle gennemtrængelig farvestof. Puls mærkning af en protein af interesse smeltet til SNAP-tag, efterfulgt af udvaskning af de resterende farvestof, giver mulighed for overvågning af forringelsen af befolkningens mærket protein og dermed til bestemmelse af protein half-life. SNAP-tags held har været anvendt til pulse-chase mærkning af proteiner og til bestemmelse af protein halveringstider i tilhænger celle kultur og i vivo5,7,8,9. En lang række SNAP-tag substrater dækker anvendte fluorescerende spectra er kommercielt tilgængelige, gør det muligt for udvælgelsen af den optimale farve for hver specifik applikation. Således kan SNAP-tags også bruges til multicolor imaging i kombination med andre fluorescerende fusion proteiner eller farvestoffer. Celle-vandtætte farvestoffer er velegnet til mærkning af membran-bundet proteiner, der henviser til, at celle-gennemtrængelige farvestoffer er gældende for overvågning både intracellulære og membran-bundet proteiner. Desuden, nogle af disse sonder udviser næsten ingen basale fluorescens og kun starte udsender en stærk fluorescerende signal ved binding til et SNAP-tag10.
Denne protokol beskriver hvordan man kan måle nedbrydningshastigheder af forskellige proteiner af interesse for enkelte celler ved hjælp af et SNAP-tag. Vi anvender her denne metode til musen embryonale (ES) stamceller kulturperler på E-cadherin, men det bør være muligt at bruge det med enhver vedhængende kulturperler celletype. Vi viser at puls mærkning af SNAP-tag fusion proteiner efterfulgt af fluorescens time-lapse imaging giver mulighed for fastsættelse af enkelt celle halveringstider af forskellige proteiner af interesse og giver en skøn for celle til celle variabiliteten af halv-liv i en befolkningen i kulturperler celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det mest afgørende skridt når benytter et SNAP-tag til at overvåge protein henfald er at sikre, at ingen resterende ubundne farvestof er tilbage på mellemlang eller i cellerne efter vask, som ellers det kan binde til nyligt producerede SNAP-tag molekyler senere i løbet af eksperimentet og ther Eby kompromis henfald kurve. Det er på den ene side opnået ved omhyggeligt udføre alle beskrevet vaske trin. På den anden side bør farvestof koncentration holdes så lavt som muligt, mens du stadig er i et område, der gi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Time-lapse mikroskopi eksperimenter blev udført på Biomolekylær Screening facilitet (BSF), EPFL. Vi takke Marc Delachaux (Service Audiovisuel, EPFL) for Videografi og redigering af filmen.
Materials
| Equipment | |||
| ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest | – | – | |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate | Corning | 353219 | |
| Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Leukemia Inhibitory factor | – | – | Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. |
| CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Dulbecco's PBS 10x concentrated | BioConcept | 3-05K00-I | |
| Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Trypsin-EDTA-Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein | R&D systems | 748-EC-050 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| FIJI | – | – | Open-source image analysis software |
| MATLAB R2014a | Mathworks | – | |
| Microsoft Excel | Microsoft | – |
References
- Zhou, P. Determining Protein Half-Lives. Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).
- Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).
- Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).
- Bojkowska, K., et al. Measuring In Vivo Protein Half-Life. Chem Biol. 18 (6), 805-815 (2011).
- Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells. Methods. 120, 65-75 (2017).
- Komatsu, T., et al. Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method. J Am Chem Soc. 133 (17), 6745 (2011).
- Deluz, C., et al. A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation. Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).
- Varshavsky, A. The N-end rule pathway and regulation by proteolysis. Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).
- Tamm, C., Pijuan Galitó, S., Annerén, C. A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing. PLoS ONE. 8 (12), e81156 (2013).
- Nagaoka, M., et al. E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation. PLoS ONE. 1 (1), e15 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).
- Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings. Methods. 85, 3-11 (2015).
- Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Comm. 8, (2017).
- Smith, K., et al. CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy. Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).
- Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. 5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation. Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).
- Lin, Y., et al. Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells. Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).
- Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation. J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).
- Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
