Eencellige kwantificering van eiwit afbraak tarieven door Time-Lapse fluorescentie microscopie in aanhangend celkweek
Summary
Dit protocol beschrijft een methode om te bepalen eiwit halfwaardetijd in één levende Adherente cellen, met behulp van pulse labeling en fluorescentie time-lapse beeldvorming van module-tag fusion eiwitten.
Abstract
Eiwitten zijn in een dynamische staat van synthese en degradatie en hun halfwaardetijd onder verschillende omstandigheden kunnen worden aangepast. Echter, meest gebruikte benaderingen te bepalen eiwit half-life zijn ofwel beperkt tot bevolking gemiddelden uit lysed cellen of vereisen het gebruik van proteïne synthese remmers. Dit protocol beschrijft een methode voor het meten van eiwit halfwaardetijd in één levende Adherente cellen, met behulp van de module-tag fusion eiwitten in combinatie met fluorescentie time-lapse microscopie. Een proteïne van belang gesmolten naar een module-tag kan worden covalent gebonden door een fluorescerende, cel permeabele kleurstof die is gekoppeld aan een benzylguanine-derivaat en het verval van de gelabelde eiwit bevolking kan worden gecontroleerd na wassen van de resterende kleurstof. Volgende cel bijhouden en kwantificering van de intensiteit van de geïntegreerde fluorescentie over tijd leidt tot een exponentiële afname kromme voor elke bijgehouden cel, zodat voor de bepaling van eiwit afbraak tarieven in afzonderlijke cellen door curve-fitting. Deze methode biedt een schatting voor de heterogeniteit van de helft-leven in een populatie van gekweekte cellen, die niet gemakkelijk worden beoordeeld door andere methoden. De hier gepresenteerde benadering is van toepassing op elk type van gekweekte Adherente cellen, uiting geven aan een proteïne van belang gesmolten aan een module-code. Hier gebruiken we muis embryonale (ES) stamcellen gekweekt op E-cadherine-coated cel cultuur platen om te illustreren hoe één cel afbraak tarieven van eiwitten met een breed scala aan helft-leven kunnen worden bepaald.
Introduction
Het is algemeen bekend dat cellulaire eiwitten ondergaan uitgebreide omzet, met synthese en degradatie tarieven specifiek voor elke proteïne en onder voorbehoud van fysiologische regelmechanismen. Traditioneel, zijn eiwit-afbraak-tarieven gemeten gebruik van bulk methoden, zoals radioactieve pulse chase analyse, of waarbij de eiwit synthese remmers zoals cycloheximide1. Meer recentelijk is te kwantificeren eiwit omzet op een wereldwijde schaal2stabiele isotoop labelen met aminozuren in celkweek (SILAC) in combinatie met massaspectrometrie opgezet. Echter, deze methoden worden beperkt door de bevolking gemiddeld, en informatie over de cel-naar-cel variabiliteit daarom verloren. Bovendien, voorbijgaande veranderingen in de afbraak van eiwitten die niet-gesynchroniseerde over de celpopulatie bevat zijn niet kunnen worden geïdentificeerd.
Als alternatief, eiwit halfwaardetijd kunnen ook worden bepaald door fluorescentie-gebaseerde benaderingen, die vaak het voordeel hebben van het verstrekken van eencellige resolutie. Bijvoorbeeld is een photoactivatable groen fluorescent proteïne (paGFP) gebruikt om te bepalen Oct4 halfwaardetijd in de vroege zoogdieren embryo3. Een andere methode om te controleren van eiwit verval in levende cellen is het gebruik van een module-tag in combinatie met fluorescentie time-lapse beeldvorming. De module-tag is een mutant versie van de DNA repair enzymen O6– alkylguanine DNA-alkyltransferase (AGT) die specifiek reageert met benzylguanine (BG) derivaten, die kunnen worden gekoppeld aan moleculaire sondes4,5, 6. daarom elke module-tag fusieproteïne onomkeerbaar kan worden aangeduid met een fluorescente, cel permeabele kleurstof. Pulse labeling van een proteïne van belang gesmolten tot de module-tag, gevolgd door wegspoeling van de resterende kleurstof, staat voor het toezicht op de afbraak van de gelabelde eiwit bevolking en dus voor de bepaling van eiwit half-life. MODULE-tags zijn met succes gebruikt voor het labelen van de puls-chase van eiwitten en voor de bepaling van eiwit halfwaardetijd in aanhanger cel cultuur en in vivo5,7,8,9. Een grote verscheidenheid van module-tag substraten die betrekking hebben op gebruikte TL spectra zijn commercieel verkrijgbaar, waardoor de selectie van de optimale kleurstof voor elke specifieke toepassing. MODULE-tags kunnen dus ook worden gebruikt voor multicolor imaging in combinatie met andere tl fusie-eiwitten of kleurstoffen. Cel-ondoordringbare kleurstoffen zijn geschikt voor het labelen van membraan-aangebonden proteïnen, terwijl cel-permeabele kleurstoffen die van toepassing zijn zijn voor het toezicht op zowel intracellulaire en membraan-gebonden eiwitten. Bovendien, sommige van deze sondes bijna geen basale fluorescentie vertonen en pas uitstoten een sterk fluorescerende signaal op binding aan een module-tag10.
Dit protocol beschrijft hoe meet je de tarieven van de afbraak van verschillende eiwitten van belang in afzonderlijke cellen met behulp van een module-tag. Hier wij deze methode toepassen op muis embryonale stamcellen (ES) cellen gekweekt op E-cadherine, maar het moet mogelijk zijn om het te gebruiken met elk celtype aanhangend gekweekte. We laten zien dat pols labeling van module-tag fusion eiwitten gevolgd door fluorescentie time-lapse imaging zorgt voor het bepalen van het eencellige half-leven van verschillende eiwitten van belang en schatting voorziet in de cel-naar-cel variabiliteit van helft-leven in een bevolking van gekweekte cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest cruciale stap bij het gebruik van een module-tag controleren eiwit verval om ervoor te zorgen is dat geen residuele ongebonden kleurstof niet in het medium of in de cellen na het wassen, anders het zou kunnen binden aan nieuw geproduceerd module-tag moleculen later in de loop van het experiment en ther Eby compromis de verval-curve. Dit is aan de ene kant bereikt door alle beschreven wassen stappen zorgvuldig uitvoert. Aan de andere kant, de kleurstof concentratie moeten zo laag mogelijk te houden, terwijl nog s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Time-lapse microscopie experimenten werden uitgevoerd op de Biomoleculaire Screening faciliteit (BSF), EPFL. Wij danken Marc Delachaux (Service Audiovisuel, EPFL) voor de videografie en het bewerken van de film.
Materials
| Equipment | |||
| ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest | – | – | |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate | Corning | 353219 | |
| Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Leukemia Inhibitory factor | – | – | Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. |
| CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Dulbecco's PBS 10x concentrated | BioConcept | 3-05K00-I | |
| Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Trypsin-EDTA-Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein | R&D systems | 748-EC-050 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| FIJI | – | – | Open-source image analysis software |
| MATLAB R2014a | Mathworks | – | |
| Microsoft Excel | Microsoft | – |
References
- Zhou, P. Determining Protein Half-Lives. Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).
- Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).
- Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).
- Bojkowska, K., et al. Measuring In Vivo Protein Half-Life. Chem Biol. 18 (6), 805-815 (2011).
- Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells. Methods. 120, 65-75 (2017).
- Komatsu, T., et al. Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method. J Am Chem Soc. 133 (17), 6745 (2011).
- Deluz, C., et al. A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation. Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).
- Varshavsky, A. The N-end rule pathway and regulation by proteolysis. Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).
- Tamm, C., Pijuan Galitó, S., Annerén, C. A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing. PLoS ONE. 8 (12), e81156 (2013).
- Nagaoka, M., et al. E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation. PLoS ONE. 1 (1), e15 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).
- Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings. Methods. 85, 3-11 (2015).
- Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Comm. 8, (2017).
- Smith, K., et al. CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy. Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).
- Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. 5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation. Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).
- Lin, Y., et al. Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells. Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).
- Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation. J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).
- Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
