Unicellulaire Quantification du taux de dégradation des protéines par microscopie de Fluorescence Time-lapse en Culture cellulaire adhérente
Summary
Ce protocole décrit une méthode pour déterminer la protéine demi-vies dans cellules adhérentes de vie unique, en utilisant des impulsions d’étiquetage et de Time-lapse imagerie de fluorescence des protéines de fusion SNAP-tag.
Abstract
Les protéines sont dans un état dynamique de synthèse et de dégradation et leur demi-vie peuvent être ajustée dans diverses circonstances. Cependant, les plus courantes des approches pour déterminer la demi-vie de la protéine sont soit limité aux moyennes de la population de cellules lysées ou exiger l’utilisation des inhibiteurs de la synthèse protéique. Ce protocole décrit une méthode pour mesurer la protéine demi-vies dans cellules adhérentes de vie unique, en utilisant des protéines de fusion SNAP-tag en combinaison avec la microscopie en fluorescence Time-lapse. Toute protéine d’intérêt fusionné à un SNAP-tag peut être liée par covalence par un colorant fluorescent, cellule perméables qui est couplé à un dérivé de benzylguanine, et la décroissance de la population de protéines marquées peut être surveillée après le lavage du colorant résiduel. Subséquente cellule de suivi et quantification de l’intensité de fluorescence intégrée sur les résultats de temps dans une courbe de décroissance exponentielle pour chaque cellule de chenilles, permettant de déterminer le taux de dégradation des protéines dans des cellules individuelles par ajustement de courbe. Cette méthode fournit une estimation de l’hétérogénéité des demi-vies dans une population de cellules cultivées, ce qui ne peut facilement être évalué par d’autres méthodes. L’approche présentée ici s’applique à n’importe quel type de cellules adhérentes exprimant une protéine d’intérêt fusionné à un SNAP-tag. Ici nous utilisons des cellules souches embryonnaires (ES) de souris cultivées sur des plaques de culture cellulaire E-cadhérine-enduit pour illustrer comment unique cellule dégradation des taux de protéines avec un large éventail de demi-vie peuvent être déterminés.
Introduction
Il est bien connu que les protéines cellulaires subissent une vaste chiffre d’affaires, avec des taux de synthèse et de dégradation étant spécifique à chaque protéine et sous réserve de la régulation physiologique. Traditionnellement, les taux de dégradation des protéines ont été mesurées à l’aide de méthodes en bloc, telles que l’analyse de pouls radioactifs de chase, ou impliquant des inhibiteurs de la synthèse protéique par exemple cycloheximide1. Plus récemment, les isotopes stables d’étiquetage avec des acides aminés dans la culture de cellules (SILAC) en combinaison avec la spectrométrie de masse a été créé pour quantifier le renouvellement des protéines sur une échelle mondiale2. Toutefois, ces méthodes sont limités par une moyenne de population, et informations sur la variabilité de la cellule-cellule sont donc perdues. En outre, des modifications passagères dans la dégradation des protéines qui sont unsynchronized dans l’ensemble de la population cellulaire ne peuvent être identifiées.
Alternativement, protéine demi-vies aussi peuvent être déterminées que par les approches axées sur la fluorescence, qui ont souvent l’avantage de fournir la résolution de cellule unique. Par exemple, une protéine fluorescente verte photoactivatable (paGFP) a servi à déterminer Oct4 Half-Life dans le début de l’embryon de mammifère3. Une autre méthode pour surveiller la décomposition des protéines dans les cellules vivantes est l’utilisation d’une balise de SNAP en combinaison avec Time-lapse imagerie de fluorescence. Le SNAP-tag est une version mutante de l’ADN réparation enzymatique O6– alkylguanine DNA-alkyltransférase (l’AGT) qui réagit spécifiquement avec benzylguanine dérivés (BG), qui peuvent être couplés à traceurs moléculaires4,5, 6. par conséquent, toute protéine de fusion SNAP-tag peut être irréversiblement marqué avec un colorant fluorescent, de perméabilité cellulaire. Impulsion d’étiquetage d’une protéine d’intérêt fusionné à la SNAP-tag, suivi du lavage du colorant résiduel, permet de surveiller la dégradation de la population de protéines marquées et, donc, pour déterminer la demi-vie de la protéine. SNAP-tags ont été utilisées avec succès pour pulse-chase marquage des protéines et pour la détermination des protéines demi-vies dans adhérentes cellule culture et in vivo5,7,8,9. Une grande variété de substrats SNAP-tag couvrant couramment utilisée les spectres fluorescents sont disponibles dans le commerce, ce qui permet la sélection de la teinture optimale pour chaque application spécifique. Ainsi, SNAP-tags utilisable aussi pour l’imagerie multicolor en combinaison avec d’autres protéines de fusion fluorescent ou colorants. Cellule-imperméable colorants conviennent pour le marquage des protéines membranaires-attaché, que perméable à la cellule colorants sont applicables pour la surveillance des protéines intracellulaires et membrane-bondissent. En outre, certaines de ces sondes ne présentent presque aucune fluorescence basale et seulement commencent à émettre un signal fluorescent fort lors de la liaison à un SNAP-tag10.
Ce protocole décrit comment mesurer le taux de dégradation des différentes protéines d’intérêt dans des cellules individuelles à l’aide d’un SNAP-tag. Ici, nous appliquons cette méthode aux cellules souches embryonnaires (ES) de souris cultivées sur la E-cadhérine, mais il devrait être possible de l’utiliser avec n’importe quel type de cellules cultivées adhérentes. Nous montrons que l’impulsion marquage des protéines de fusion de SNAP-tag suivies de Time-lapse imagerie de fluorescence permet de déterminer les demi-vies monocellulaire de diverses protéines d’intérêt et fournit une estimation de la variabilité de la cellule-cellule des demi-vies dans un population des cellules cultivées.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’étape plus cruciale lorsque vous utilisez un SNAP-tag pour surveiller la décomposition des protéines, c’est pour s’assurer qu’aucun colorant résiduel non lié n’est laissé dans le milieu ou dans les cellules après lavage, sinon il pourrait lier à nouveau produit des molécules plus tard au cours de l’expérience et le ther SNAP-tag Eby compromis la courbe de décroissance. Il s’agit d’une part, obtenue en exécutant avec soin toutes les étapes de lavage décrite. En revanche, la concentration de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Time-lapse microscopie expériences furent réalisées à Biomolecular Screening Facility (BSF), EPFL. Nous remercions Marc Delachaux (Service Audiovisuel, EPFL) pour la vidéographie et le montage du film.
Materials
| Equipment | |||
| ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest | – | – | |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate | Corning | 353219 | |
| Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Leukemia Inhibitory factor | – | – | Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. |
| CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Dulbecco's PBS 10x concentrated | BioConcept | 3-05K00-I | |
| Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Trypsin-EDTA-Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein | R&D systems | 748-EC-050 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| FIJI | – | – | Open-source image analysis software |
| MATLAB R2014a | Mathworks | – | |
| Microsoft Excel | Microsoft | – |
References
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