Количественная оценка одноклеточных темпы деградации белка с покадровой флуоресцентной микроскопии в культуре адэрентных клеток
Summary
Этот протокол описывает метод для определения белков полураспада в отдельные живые адэрентных клеток, используя импульсный маркировки и флуоресценции покадровой изображений SNAP-тег синтеза белков.
Abstract
Белки находятся в динамическом состоянии синтеза и деградации и их половина жизнь может быть скорректирована при различных обстоятельствах. Однако, наиболее часто используемые подходы для определения белков half-life, либо ограничен населения средние от лизированных клетках или требовать использования ингибиторов синтеза белка. Этот протокол описывает метод для измерения белка полураспада в отдельные живые адэрентных клеток, используя SNAP-тег синтез белков в сочетании с покадровой микроскопии флуоресцирования. Любой протеин интереса, сливается с SNAP-тег можно ковалентно обязательность флуоресцентные, клетки проницаемых краситель, который соединен к производным benzylguanine, и распад помечены белка населения может контролироваться после вымывания остатков красителя. Последующие ячейки отслеживания и количественная оценка интенсивности флуоресценции комплексной времени результаты в кривой экспоненциального распада для каждой отслеживаемой ячейки, позволяя определить темпы деградации белка в одиночных клетках кривой. Этот метод обеспечивает оценку для гетерогенности полураспада в популяции культивируемых клеток, которые легко могут оцениваться другими методами. Представленный здесь подход применим к любому типу культивировали адэрентных клеток, выражая протеин интереса, сливается с SNAP-тег. Здесь мы используем клетки мыши эмбриональных стволовых (ES), выращенных на E-Кадгерины покрытием клетки культуры пластин для иллюстрации как одной ячейки деградации ставки белков с широким кругом половина-жизнь может быть определено.
Introduction
Хорошо известно, клетчатые протеины проходят обширные оборот, с специфичны для каждого белка и подлежит физиологической регуляции синтеза и деградации ставки. Традиционно темпы деградации белка являются измеренные с помощью массовых такие методы, как анализ Чейз радиоактивных импульса, или с участием ингибиторы синтеза белка, такие как циклогексимида1. Совсем недавно стабильный изотоп маркировки с аминокислоты в клеточной культуре (SILAC) в сочетании с масс-спектрометрии была создана для количественного определения белка оборот на глобальном уровне2. Однако эти методы ограничены путем усреднения населения, и поэтому будут потеряны сведения об изменчивости к ячейке. Кроме того не могут быть определены временные изменения в деградации белков, которые являются несинхронизированные всей популяции клеток.
Кроме того белок полураспада также может определяться на основе флуоресценции подходы, которые часто имеют преимущество предоставления одной ячейки резолюции. Например photoactivatable Зеленый флуоресцентный белок (paGFP) был использован для определения Oct4 half-life в ранних млекопитающих эмбриона3. Другой метод для мониторинга распада белка в живых клетках является использование оснастки тега в сочетании с работой с образами замедленной флуоресценции. SNAP-тег — это мутант версия ДНК6ремонт фермента O – alkylguanine ДНК alkyltransferase (AGT), специально реагирует с benzylguanine (BG) производные финансовые инструменты, которые могут быть связаны с молекулярные датчики4,5, 6. Таким образом, любой протеин сплавливания SNAP-тегов могут необратимо помечены флуоресцентные, проницаемых краска клеток. Пульс маркировки протеина интереса, сливается с SNAP-тег, после вымывания остатков краски, позволяет для контроля за деградацией населения помечены белка и, таким образом, для определения белков half-life. SNAP-теги были успешно использованы для импульса Чейз маркировки белков и для определения белка в приверженца полураспада клеточной культуры и в естественных условиях5,,78,9. Большое разнообразие субстратов SNAP-тег охватывающей обычно используются люминесцентные спектры коммерчески доступных, позволяя выбор оптимального краситель для каждого конкретного приложения. Таким образом SNAP-Теги также может использоваться для многоцветного воображения в сочетании с другими флуоресцентные синтез белков или красителей. Ячейки непроницаемый красители подходят для маркировки привязал мембранных белков, тогда как клетки проницаемой красители применяются для мониторинга внутриклеточные и мембраны прыгните белков. Кроме того некоторые из этих датчиков демонстрируют почти не базальная флуоресценции и только начать, испуская флуоресцентные сигналом на привязку к SNAP-тег10.
Этот протокол описывает как измерять темпы деградации различных протеинов интереса в одиночных клетках, с помощью тега привязки. Здесь мы применяем этот метод к мыши эмбриональных стволовых (ES) клетки культивировали на E-Кадгерины, но она должна быть возможность использовать его с любым типом адэрентных культивируемых клеток. Мы показывают, что пульс маркировки SNAP-тег синтез белков, следуют флуоресценции покадровой изображений позволяет для определения одной ячейки полураспада различных протеинов интереса и дает оценку для ячейки к ячейке изменчивость полураспада в численность населения культивируемых клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Самый важный шаг при использовании тега привязки для мониторинга распада белка обеспечить, что без остаточного несвязанных краска остается в среде или в клетках после мытья, поскольку в противном случае она может связывать недавно подготовила SNAP-тег молекул позднее в ходе эксперимент…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Покадровой микроскопии эксперименты были проведены на биомолекулярных скрининг фонда (ФСБ), EPFL. Мы благодарим Марк Delachaux (служба официально, EPFL) за видеосъемка и монтаж фильма.
Materials
| Equipment | |||
| ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest | – | – | |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate | Corning | 353219 | |
| Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Leukemia Inhibitory factor | – | – | Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. |
| CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Dulbecco's PBS 10x concentrated | BioConcept | 3-05K00-I | |
| Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Trypsin-EDTA-Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein | R&D systems | 748-EC-050 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| FIJI | – | – | Open-source image analysis software |
| MATLAB R2014a | Mathworks | – | |
| Microsoft Excel | Microsoft | – |
References
- Zhou, P. Determining Protein Half-Lives. Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo. Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).
- Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).
- Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells. Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).
- Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).
- Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis. J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).
- Bojkowska, K., et al. Measuring In Vivo Protein Half-Life. Chem Biol. 18 (6), 805-815 (2011).
- Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells. Methods. 120, 65-75 (2017).
- Komatsu, T., et al. Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method. J Am Chem Soc. 133 (17), 6745 (2011).
- Deluz, C., et al. A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation. Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).
- Varshavsky, A. The N-end rule pathway and regulation by proteolysis. Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).
- Tamm, C., Pijuan Galitó, S., Annerén, C. A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing. PLoS ONE. 8 (12), e81156 (2013).
- Nagaoka, M., et al. E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation. PLoS ONE. 1 (1), e15 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hilsenbeck, O., et al. Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties. Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).
- Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings. Methods. 85, 3-11 (2015).
- Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nature Comm. 8, (2017).
- Smith, K., et al. CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy. Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).
- Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. 5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation. Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).
- Lin, Y., et al. Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells. Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).
- Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation. J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).
- Gautier, A., et al. An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells. Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).
- Los, G. V., et al. HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
