Sola célula cuantificación de las tasas de degradación de proteína por microscopia de fluorescencia Time-lapse en cultivo de células adherentes
Summary
Este protocolo describe un método para determinar proteína vida media en las células adherentes vivas sola, con pulso de etiquetado e imagen Time-lapse de fluorescencia complemento etiqueta de proteínas de fusión.
Abstract
Las proteínas están en un estado dinámico de la síntesis y degradación y su vida media se pueden ajustar bajo diversas circunstancias. Sin embargo, más utilizados enfoques para determinar la vida media de la proteína pueden ser limitadas a medias de la población de las células sometidas a lisis o requieren el uso de inhibidores de la síntesis de proteínas. Este protocolo describe un método para medir la proteína vida media en las células adherentes solo vivas, utilizando proteínas de fusión SNAP tag en combinación con Time-lapse de microscopía de fluorescencia. Cualquier proteína de interés unida a una etiqueta de cierre puede ser covalentemente por, célula permeable colorante fluorescente que se une a un derivado de benzylguanine, y el decaimiento de la población proteínas etiquetados puede controlarse después de lavado del tinte residual. Celda posterior seguimiento y cuantificación de la intensidad de fluorescencia integrada por los resultados del tiempo en una curva de decaimiento exponencial para cada celda de orugas, lo que permite determinar las tasas de degradación de proteínas en las células por ajuste de curvas. Este método proporciona una estimación de la heterogeneidad de la vida media de una población de células cultivadas, que no se puede evaluar fácilmente por otros métodos. El enfoque presentado aquí es aplicable a cualquier tipo de cultivos de células adherentes expresando una proteína de interés unida a una etiqueta de cierre. Aquí utilizamos células madre embrionarias (ES) de ratón cultivadas en placas de cultura de E-cadherin-revestida de la célula para ilustrar cómo única degradación celular tipos de proteínas con una amplia gama de vida media pueden ser determinadas.
Introduction
Es bien sabido que las proteínas celulares someterse a rotación extensa, con tasas de síntesis y degradación es específica para cada proteína y conforme a la regulación fisiológica. Tradicionalmente, las tasas de degradación de proteína han sido medidos utilizando métodos a granel, tales como el análisis de chase de pulso radiactivo, ni recurrir a inhibidores de la síntesis de proteínas como la cicloheximida1. Más recientemente, Isótopo estable que etiqueta con aminoácidos en cultura de célula (SILAC) en combinación con la espectrometría de masas se ha establecido para cuantificar el volumen de la proteína en una escala global2. Sin embargo, estos métodos están limitados por un promedio de población, y por lo tanto se pierde la información sobre la variabilidad de célula a célula. Además, no se puede identificar cambios transitorios en la degradación de las proteínas que son sincronización entre la población de la célula.
Como alternativa, proteínas de vida media también puede ser determinado por los enfoques basados en la fluorescencia, que a menudo tienen la ventaja de proporcionar resolución unicelular. Por ejemplo, una proteína fluorescente verde photoactivatable (paGFP) se ha utilizado para determinar Oct4 Half-Life en el mamífero embrión temprano3. Otro método para controlar la descomposición de proteína en las células vivas es el uso de una etiqueta de cierre en combinación con imágenes de Time-lapse de fluorescencia. La etiqueta de cierre es una versión mutante de la DNA reparación enzimática O6– alkylguanine ADN-Alquilotransferasa (AGT) que reacciona específicamente con benzylguanine derivados (BG), que se pueden acoplar a sondas moleculares4,5, 6. por lo tanto, cualquier proteína de la fusión de SNAP tag puede etiquetarse irreversible con un colorante fluorescente, de permeable de la célula. Pulso de etiquetado de una proteína de interés unida a la etiqueta de complemento, seguida de lavado del tinte residual, permite monitoreo de la degradación de la población de proteínas marcadas y así para determinar la vida media de la proteína. Etiquetas de cierre se han utilizado con éxito para el pulso-persiga el etiquetado de proteínas y para la determinación de proteína vida media en adherente celular cultivo e in vivo5,7,8,9. Una gran variedad de sustratos de SNAP tag cubriendo comúnmente utilizado los espectros fluorescentes están disponibles en el mercado, lo que permite la selección del colorante óptimo para cada aplicación específica. Por lo tanto, también pueden utilizarse SNAP-etiquetas para imágenes multicolor en combinación con otras proteínas de fusión fluorescentes o colorantes. Tintes de celda impermeable son adecuados para el etiquetado de las proteínas de membrana atada, mientras que tintes permeable a la célula son aplicables para el control de proteínas intracelulares y de membrana-limitan. Además, algunas de estas puntas de prueba no exhiben casi ninguna fluorescencia basal y sólo empezar a emitir una fuerte señal fluorescente sobre Unión SNAP tag10.
Este protocolo describe cómo medir las tasas de degradación de diversas proteínas de interés en las células usando una etiqueta de cierre. Aquí aplicamos este método a células madre embrionarias (ES) de ratón cultivadas en la E-cadherina, pero debería ser posible usarlo con cualquier tipo de cultivo de células adherentes. Demostramos que pulso etiquetado complemento etiqueta proteínas de fusión seguidas por imágenes de Time-lapse de fluorescencia permite determinar la vida media de unicelular de diferentes proteínas de interés y proporciona una estimación de la variabilidad de célula a célula de vida media en un población de células cultivadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El paso más crucial cuando se utiliza una etiqueta de cierre para controlar la descomposición de la proteína asegurar que ningún tinte residual queda en el medio o en las células después del lavado, como si no lo puede enlazar a recién producido moléculas de complemento etiqueta más adelante en el curso de la experiencia y compromiso la curva de decaimiento de la Eby. Se trata por un lado logrado realizando cuidadosamente todos los pasos de lavado descrito. Por otro lado, la concentración de tinte se debe mante…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Se realizaron experimentos de microscopía de Time-lapse en la Biomolecular Screening Facility (BSF), EPFL. Agradecemos a Marc Delachaux (Service Audiovisuel, EPFL) para la grabación y edición de la película.
Materials
| Equipment | |||
| ES cell line expressing a SNAP-tag fusion protein of interest | – | – | |
| Falcon 100 mm TC-Treated Cell Culture Dish | Corning | 353003 | |
| 96 Well, Black/Clear, Tissue Culture Treated Plate | Corning | 353219 | |
| Neubauer-improved counting chamber, 0.1 mm | Marienfeld-superior | 640030 | |
| CO2 Incubator | Panasonic | MCO-170AICUV-PE | |
| Centrifuge 5804 R | Eppendorf | 5804000528 | |
| InCell Analyzer 2200 Cell Imaging System | GE Healthcare Life Sciences | 29027886 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Glasgow Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | G5154 | |
| Fetal Bovine Serum, embyonic stem cell-qualified | ThermoFisher | 16141-079 | |
| Sodium pyruvate solution | Sigma-Aldrich | 113-24-6 | |
| Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin | BioConcept | 4-01F00H | |
| L-Glutamine 200mM | ThermoFisher | 25030-024 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 63689-25ML-F | |
| Leukemia Inhibitory factor | – | – | Produced in the lab by transient transfection of HEK-293T cells, followed by collection and filtering of the supernatant. |
| CHIR99021 (GSK-3 Inhibitor XVI) | Merck Millipore | 361559 | |
| PD 0325901 | Sigma-Aldrich | 391210-10-9 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | |
| Dulbecco's PBS 10x concentrated | BioConcept | 3-05K00-I | |
| Dulbecco's PBS Without Ca++/Mg++ | BioConcept | 3-05F29-I | |
| Trypsin-EDTA-Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Recombinant Mouse E-Cadherin Fc Chimera protein | R&D systems | 748-EC-050 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
| SNAP-Cell 647-SiR | New England BioLabs | S9102S | |
| FluoroBrite DMEM | ThermoFisher | A18967-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| FIJI | – | – | Open-source image analysis software |
| MATLAB R2014a | Mathworks | – | |
| Microsoft Excel | Microsoft | – |
References
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