במסמך זה, אנו מציגים עבור התרבות תלת-ממד של עכברוש פרוטוקול תאי המוח-derived עכשיו, דונלד, לרבות האסטרוציטים, מיקרוגלייה oligodendrocytes להפוך. נדגים התרבות התא הראשי, סינתזה הידרוג חומצה היאלורונית methacrylated (חמה), HAMAphoto-הפילמור ותא כימוס, דוגמת עיבוד עבור הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונים קונאפוקלית של סריקה.
מערכת העצבים המרכזית, רבים פציעות חריפה, הפרעות ניווניות, באותה מידה כמו מושתל התקנים או biomaterials הנדסה לאחור כדי לשפר את התוצאה הפונקציה לאותה התוצאה: דלקת עודף מוביל gliosis, cytotoxicity, ו/או היווצרות צלקת גליה קולקטיבי להחריף פציעה או למנוע שחזור בריא. עם הכוונה ליצירת מערכת דגם גליה הצלקת היווצרות והלימוד תהליכים דלקתיים, יש לנו שנוצר לפיגום תא 3D המסוגל העיקרי בתרבית תאי גליה: מיקרוגלייה לווסת את התגובה גוף זר, ליזום אירוע דלקתיות, האסטרוציטים מגיבים ליצירת צלקת סיביים, ו אוליגודנדרוציטים כי הם בדרך כלל פגיע לפגיעה דלקתית. העבודה הנוכחית מספק שיטה צעד אחר צעד מפורט עבור פבריקציה נוספת, תרבות, מיקרוסקופיים אפיון לפיגום מבוססי חומצה היאלורונית הידרוג 3D עם עכברוש שעברו אנקפסולציה המוח-derived גלייה. יתר על כן, פרוטוקולים עבור אפיון של כימוס תא, לגרדום הידרוג על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי immunofluorescence וסריקת מודגמות, כמו גם היכולת לשנות לגרדום עם מצעים ביו, עם התאגדות של תערובת מסחרית פרופריה הבסיס לאינטגרציה תא משופרת.
דלקת של מערכת העצבים המרכזית (CNS) כבר מזמן נחשב סימן היכר של אקוטי (למשל, שבץ איסכמי, מוח טראומטית, פגיעה בחוט השדרה) כרונית (כגון אלצהיימר, פרקינסון של ומחלות של הנטינגטון) פגיעה CNS, אבל הוא מוכר יותר ויותר כתורם סיבתי ועד מנוטלי הפרעות ניווניות. מתמשכת או דלקת לא מתאים יכול לגרום פגיעה עצבית ו demyelination(טרשת נפוצה) , ולהשפיע באופן שלילי התפתחות המוח (למשל, סכיזופרניה, אוטיזם) ומצבי רוח (למשל, דיכאון, חרדה הפרעה דו קוטבית). יתר על כן, הרומן אסטרטגיות טיפוליות באמצעות מכשירי מושתלת (למשל., מוח-מחשב-ממשקים1,2,3, מוחי עמוק גירוי4,5, תוך microstimulation6,7,8,9,10) ליצור תגובה דלקתית צפוי על הממשק בין ההתקן לבין מערכת העצבים וכתוצאה מכך תגובת ומבחינה שיכולים לגרום לאובדן יעילות או התקן כשל במהלך תקופת החיים של השתל11. דלקת מערכת העצבים הוא בדרך כלל ביוזמת מיקרוגלייה, אשר מתפקד בתור תאים חיסוניים תושב של מערכת העצבים אחראי מעקב רקמות והרכבה התגובה גוף זר (שנסקרה12). בהתאם לחומרת עלבון, האות מיקרוגלייה ואת גיוס נוספים התא סוגי פגיעה באתר. באופן ספציפי, מיקרוגלייה להפעיל את האסטרוציטים, אשר בתורו לשמש משני תאים דלקתיים ומהווים מחסום הגנה החוצץ צפופה שתכיל13,אתר פגיעה14. מיקרוגלייה יכול ליזום גם של המפל פעילות התאים של המערכת החיסונית היקפיים, אשר עלולה לגרום להתמוטטות של BBB להתיר חדירה המערכת החיסונית (נבדקה תוך התייחסות15).
במקרה של התקנים מושתל לתוך מערכת העצבים, רקמת נזק הנובע התקן הכניסה, כמו גם המשך הנוכחות של המכשיר זר עשוי ליזום תהליך הנקרא גליה הצטלקות. בתהליך זה, מיקרוגלייה להגר, להתרבות באתר של פציעה. הם גם ליזום שחרורו של גורמים דלקתיים כדי לנטרל איומים פוטנציאליים ולגייס גלייה נוספים. לאחר מכן, האסטרוציטים מופעל הפך היפרטרופית, להתחיל לבצע את המכשיר מושתל להקים מכשול סיביים רציפה16. איתות דלקתיות משמש גם כדי לקדם את נסיגתם של תהליכים עצביים מסביבתן של השתל, בסופו של דבר ומגייסת fibroblasts כדי לחזק את הצלקת גליה המתפתח17. Oligodendrocytes להפוך, אחראי לנדן נוירונים בהמיאלין לשיפור מוליכות, אינם שורדים תהליך זה, התאים רחוקים הם למחיצות של השתל על ידי צלקת18. גליה צלקות במידה רבה מפחית את תפקוד ואת משך חיים של התקנים מושתל, במיוחד עבור הקלטה אלקטרודות, ומגישה בסופו של דבר כדי להגביל את הפונקציונליות של ממשקים עצביים19.
מספר גישות נוצלה כדי להגדיל את התאימות ואת ממשק לפעילות התקנים מושתל22,2321,20,מערכת העצבים המרכזית. סקירה מקיפה זמין על עיצוב ממשקים עצביים אלה24מסתיימים. האסטרטגיות הבולטים כוללים סביב האלקטרודה עם ציפויים תואם כגון polyelthyleneglycol (PEG), חומצות polylactic-co-גליקולי (PLGA)25, או שיפור האלקטרודה עם פולימרים מוליכים כגון פולי (אתילן dioxythiophene) (PEDOT), ו- polypyrrole (PPy)26,27,28,29,30,31. Bioactive ציפויים גם יש כבר מועסקים לספק רמזים על רקמה עצבית באמצעות ליגנדים נגזר מטריצה חוץ-תאית, כולל collagens, fibronectins, חומצות היאלורונית32,33,34 ,35,36,37. Bioactivity של ציפויים אלה נחקרו עוד יותר עם מערכות לשחרור פקטורי גדילה כדי לחקות את התא טבעי הפרשות30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. בעת ובעונה אחת, כמה קבוצות מחקר שבחרו לעצב מחדש את הגיאומטריה אלקטרודה, גמישות ויכולת הרכב כדי להקטין את ההתאמה מכני בין ההתקן לבין רקמת51,52,53 ,54,55,56,57. בסך הכל, אסטרטגיות אלו הובילו מבטיח שיפורים רבים בהתקנים פנים עצבית הדור הבא, אולם התאימות לטווח ארוך היא נושא מתמשך התקדמות עשוי להיות הכבידו על ידי מודלים מורכב ולגזול vivo .
גישות מבוססות על מודל בעלי חיים ניתן להגביל את התפוקה ניסיוני, להגדיל את עלויות של בדיקות התאימות אלקטרודה. במבחנה ניגש באמצעות תרבית תאים קונבנציונאלי טכניקות מציעים חלופה חסכונית יותר אבל להיכשל כדי לסכם את רוב המורכבות של האינטראקציה בין ההתקן לבין רקמת58. בפרט, בדיקה של ציפוי פני השטח באמצעות גבולות התרבות התא 2D הדגמים של אלקטרודה הגיאומטריה ואת ההשפעה של אי-התאמה מכני, micromotion חשבתי לתרום ליצירת תגובה מארח לתרום התקן כשל59 , 60.
כדי להתגבר על בעיות הקשורות תרבית תאים 2D, הידרוג תרביות של תאים עצביים פותחו עבור מגוון רחב של יישומים, מחקרים61, לכוון תאי העצבים בידול62, כדי להבין את המחלה מסלולים63,64, או שכבתית ב תרבות שיתוף עם סוגי תאים אחרים דגם נדידת תאים, neuroprotection, או דגם רקמה microenvironments61. Hydrogels נוצרות בקלות בגדלים שונים, גיאומטריות ניתן לשלב סוגים רבים ושונים של תרביות תאים ראשי או מונצחים, ויש לבצע ניתוח על ידי טכניקות נפוצות כגון מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. כדי ליצור מודל של תהליך הצטלקות גליה, יש לאחרונה פיתחה ואנו אפיינה מערכת הידרוג 3D מבוסס חומצה היאלורונית לניסויים תפוקה גבוהה של התגובה גליה מושתל אלקטרודות (איור 1)65. מערכת זו היא בעלת מספר יתרונות ברורים: 1) ראשי תאי גליה (מיקרוגלייה, האסטרוציטים, ו אוליגודנדרוציטים) כמוסות במטריצה תלת-ממדית מורכבת של פולימרים של חומצה היאלורונית, המהווה מרכיב אנדוגני מטריצה חוץ-תאית; 2 נוקשות מטריקס) יכול להיות ‘מכוון’ ליצור מחדש את התכונות המכאניות של המוח או חוט השדרה רקמות; . ו-3) ניתן לכלול תאים המטריצה בגישה ספסל-העליון מהירה באמצעות photopolymerization עם אור ירוק, הגבלת רעילות במהלך אנקפסולציה. מערכת זו מאפשרת תכונות מפתח של הביו ויוו : התקנים מוכנסים את הידרוג בצורה דומה לכל רקמות, ואת התגובה התאית למכשירים מושתל מנוטרים עבור מגוון רחב של פרמטרים65. אלה כוללים מכני אי-התאמה בין התקנים של ציפויים הידרוג של מבנים שונים פולסים גירוי חשמלי. מערכת זו כוללת גם אוליגודנדרוציטים מבשרי קרובים, לעתים קרובות מגויס ב צלקות גליה ובהווה. שלהם נזק, מוות phagocytosis מאת מיקרוגלייה הן מאוד מעידה על פגיעה דלקתית, כמו דוגמנית מופחת הצטלקות או שחזור, יש להם את היכולת להפגין re-myelination של הנוירונים66.
במסמך זה אנו נתאר שיטת סינתזה ועל היווצרות היברידית חומצה היאלורונית hydrogels בשילוב עם ניסוחים קרום המרתף זמינים מסחרית כדי לשפר את התא ההתאגדות. עוד יותר, אנו נדגים שילוב של ראשי תאי גליה בתרבית (מיקרוגלייה, האסטרוציטים, ו אוליגודנדרוציטים) וניתוח של תרבות צמיחה באמצעות immunocytochemistry ומיקרוסקופיה קונפוקלית
לקראת המטרה של יצירת מערכת תרבות 3D דגם bioreactivity גליה ותהליך הצטלקות גליה, פיתחנו מערכת יכול לתמוך העיקרי מיקרוגלייה בתרבית, האסטרוציטים ו אוליגודנדרוציטים ומאפשרת חזקים אפיון תא אינטראקציות תא-תא ומורפולוגיה. מ micrographs המוצג, המורפולוגיה של כל סוג התא היה שונה במובהק עם 2D, 3D-חמה ו 3D HAMA-הבזליי…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מודים תמיכה כספית NSERC, CFI, AIHS, שירותי בריאות אלברטה, התרומה דייבי לחקר המוח.
1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization | |||
Hyaluronic acid (HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi, MW: 1.5 – 1.8 X 10^6 |
Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
Ethanol (EtOH) | Commerical Alcohols Inc. | Anhydrous | |
Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets | Fisher Scientific | 18912014 | |
Triethanolamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
EosinY (EY) | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
Beaker (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
Beaker (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
pH paper (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2. Materials for glial cell isolation and cell culture | |||
P1-2 Sprague Dawley rat pups | Charles River | CD Sprague Dawley rat strain code 001 | |
Dissector scissors – slim blades (small) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
Surgical scissors – Toughcut (large) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
Curved fine forceps (Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
Penicillin-streptomycin (PS) | Gibco | 15140-122 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
10 mL serological pipette | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
25 mL serological pipette | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
Petri dish (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Petri dish (100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Microscope Coverslip (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy) | |||
Mouse monoclonal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
Rabbit anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
Chicken anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Buffered (10%) |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
Paraformaldehyde | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | Buffered (8%) |
Guteraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16019 | Buffered (8%) |
Osmium tetraoxide | Electon Microscopy Sciences | 19152 | Buffered (2%) |
Hexamethyldilazane (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
Ethanol (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | Anhydrous |
Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |