इस के साथ साथ, हम astrocytes, microglia, और oligodendrocytes सहित चूहे मस्तिष्क व्युत्पंन glia कोशिकाओं, की 3 डी संस्कृति के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम प्राथमिक सेल संस्कृति, methacrylated hyaluronic एसिड (हामा) hydrogel संश्लेषण, HAMAphoto-बहुलकीकरण और कोशिका encapsulation, और फोकल और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए नमूना प्रसंस्करण का प्रदर्शन ।
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में, कई तीव्र चोटों और neurodegenerative विकारों, साथ ही प्रत्यारोपित उपकरणों या एक ही परिणाम में कार्य परिणाम को बढ़ाने के लिए इंजीनियर: अतिरिक्त सूजन gliosis की ओर जाता है, cytotoxicity, और/ एक glial निशान है कि सामूहिक चोट ख़राब या स्वस्थ वसूली को रोकने के गठन । मॉडल glial निशान गठन और अध्ययन भड़काऊ प्रक्रियाओं के लिए एक प्रणाली बनाने के इरादे के साथ, हम आवास प्राथमिक प्रसंस्कृत glial कोशिकाओं में सक्षम एक 3 डी सेल पाड़ उत्पन्न किया है: microglia कि विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया को विनियमित और शुरू भड़काऊ घटना, astrocytes कि एक रेशेदार निशान फार्म का जवाब है, और oligodendrocytes है कि आम तौर पर भड़काऊ चोट के लिए कमजोर कर रहे हैं । वर्तमान काम एक विस्तृत कदम दर कदम विधि निर्माण, संस्कृति के लिए प्रदान करता है, और एक hyaluronic एसिड की सूक्ष्म लक्षण वर्णन-encapsulated चूहे मस्तिष्क व्युत्पंन glial कोशिकाओं के साथ 3 डी hydrogel पाड़ आधारित । इसके अलावा, सेल encapsulation और फोकल इम्यूनोफ्लोरेसेंस और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा hydrogel पाड़ के लक्षण वर्णन के लिए प्रोटोकॉल का प्रदर्शन कर रहे हैं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से क्षमता को सक्रिय सब्सट्रेट के साथ पाड़ को संशोधित करने के साथ, बेहतर सेल एकीकरण के लिए एक वाणिज्यिक बेसल लेमिना मिश्रण का निगमन ।
केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) की सूजन लंबे समय तक तीव्र (जैसे, कोरोनरी स्ट्रोक, दर्दनाक मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी की चोट) और जीर्ण (जैसे अल्जाइमर, पार्किंसंस, और हटिंगटन के रोगों) सीएनएस चोट की एक बानगी माना गया है, लेकिन तेजी से neurodegenerative और neuropsychiatric विकारों के लिए एक कारण योगदानकर्ता के रूप में मांयता प्राप्त है । निरंतर या अनुचित सूजन तंत्रिका चोट और ग्रासलेल्या पैदा कर सकता है (जैसे कई स्केलेरोसिस), और नकारात्मक मस्तिष्क के विकास को प्रभावित (उदा, एक प्रकार का पागलपन, आत्मकेंद्रित) और मूड राज्यों (जैसे, अवसाद, चिंता , द्विध्रुवी विकार) । इसके अलावा, उपंयास उपचारात्मक प्रत्यारोपण उपकरणों का उपयोग रणनीतियों (जैसे, मस्तिष्क कंप्यूटर-इंटरफेस1,2,3, गहरी मस्तिष्क उत्तेजना4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,9,10) डिवाइस और एक में जिसके परिणामस्वरूप सीएनएस के बीच इंटरफेस पर एक पूर्वानुमान भड़काऊ प्रतिक्रिया उत्पन्न सुरक्षात्मक ऊतक प्रतिक्रिया है कि प्रत्यारोपण के जीवनकाल में प्रभावकारिता या डिवाइस विफलता के नुकसान का कारण बन सकता है11. सीएनएस में सूजन आम तौर पर microglia द्वारा शुरू की जाती है, जो ऊतक निगरानी के लिए जिंमेदार सीएनएस के निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के रूप में कार्य और विदेशी शरीर की प्रतिक्रिया बढ़ते (12की समीक्षा की) । एक अपमान की गंभीरता पर निर्भर करता है, microglia संकेत और एक चोट साइट के लिए अतिरिक्त सेल प्रकार की भर्ती । विशेष रूप से, microglia सक्रिय astrocytes, जो बारी में माध्यमिक भड़काऊ कोशिकाओं के रूप में कार्य और एक घने सुरक्षात्मक बाधा फार्म के लिए एक चोट साइट13,14शामिल हैं । Microglia भी परिधीय प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं में एक गतिविधि झरना शुरू कर सकते हैं, जो BBB के टूटने में परिणाम के लिए प्रतिरक्षा घुसपैठ की अनुमति कर सकते है (संदर्भ में समीक्षा की15) ।
सीएनएस में प्रत्यारोपित उपकरणों के मामले में, ऊतक क्षति डिवाइस प्रविष्टि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विदेशी डिवाइस के जारी उपस्थिति से उत्पंन एक प्रक्रिया glial scarring शुरू हो सकता है । इस प्रक्रिया में, microglia करने के लिए और पैदा चोट के स्थल पर माइग्रेट । उंहोंने यह भी भड़काऊ कारकों की रिहाई के लिए संभावित खतरों बेअसर और अतिरिक्त glial कोशिकाओं की भर्ती शुरू करते हैं । बाद में, सक्रिय astrocytes hypertrophic हो जाते हैं और एक सतत रेशेदार बाधा के रूप में प्रत्यारोपित डिवाइस encapsulating शुरू16. भड़काऊ संकेत भी प्रत्यारोपण के आसपास के क्षेत्र से ंयूरॉन प्रक्रियाओं की वापसी को बढ़ावा देने के लिए कार्य करता है और अंततः fibroblasts रंगरूटों विकासशील glial निशान17को सुदृढ़ करने के लिए । oligodendrocytes, myelin में न्यूरॉन्स आवरण के लिए जिंमेदार कंडक्टर बढ़ाने के लिए, इस प्रक्रिया को जीवित नहीं है और दूर कोशिकाओं के निशान से प्रत्यारोपण से विभाजित है18. Glial scarring बहुत समारोह और प्रत्यारोपित उपकरणों के जीवनकाल कम कर देता है, विशेष रूप से इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग के लिए, और अंत में तंत्रिका इंटरफेस की कार्यक्षमता को सीमित करने के लिए कार्य करता है19.
कई दृष्टिकोण सीएनएस20,21,22,23में प्रत्यारोपित उपकरणों की असंगति और इंटरफेस गतिविधि को बढ़ाने के लिए शोषण किया गया है । एक व्यापक समीक्षा इन तंत्रिका इंटरफेस के24के अनुरूप डिजाइन पर उपलब्ध है । सबसे प्रमुख रणनीतियों जैसे polyelthyleneglycol (खूंटी), polylactic-co-glycolic एसिड (PLGA)25, या ऐसे पाली के रूप में प्रवाहकीय पॉलिमर के साथ इलेक्ट्रोड को बढ़ाने के रूप में संगत कोटिंग्स के साथ इलेक्ट्रोड आसपास शामिल (ईथीलीन dioxythiophene) (PEDOT), और polypyrrole (PPy)26,27,28,29,30,31. सक्रिय कोटिंग्स भी तंत्रिका ऊतक कोलेजन, fibronectins, और hyaluronic एसिड सहित extracellular मैट्रिक्स से व्युत्पंन लाइगैंडों का उपयोग कर विकास के लिए cues प्रदान करने के लिए नियोजित किया गया है३२,३३,३४ ,३५,३६,३७. इन कोटिंग्स की है और आगे का पता लगाया गया है विकास फैक्टर रिलीज़ सिस्टम के साथ प्राकृतिक सेल स्राव का अनुकरण करने के लिए30,३८,३९,४०,४१ , ४२ , ४३ , ४४ , ४५ , ४६ , ४७ , ४८ , ४९ , ५०. साथ ही, कुछ अनुसंधान समूहों इलेक्ट्रोड ज्यामिति, लचीलापन, और संरचना remodel करने के लिए उपकरण और ऊतक के बीच यांत्रिक बेमेल कम करने के लिए चुना है५१,५२,५३ ,५४,५५,५६,५७. कुल मिलाकर, इन रणनीतियों अगली पीढ़ी तंत्रिका चेहरे उपकरणों में कई होनहार सुधार करने के लिए नेतृत्व किया है, लेकिन दीर्घकालिक अनुकूलता एक पर जा रहे मुद्दे और प्रगति जटिल और समय लेने वाली vivo मॉडल में बाधा हो सकती है .
पशु मॉडल आधारित दृष्टिकोण प्रयोगात्मक प्रवाह को सीमित कर सकते हैं और इलेक्ट्रोड के परीक्षण के लिए संगतता की लागत में वृद्धि. इन विट्रो में पारंपरिक सेल संस्कृति तकनीक का उपयोग दृष्टिकोण एक अधिक लागत प्रभावी विकल्प प्रदान करते हैं, लेकिन डिवाइस और ऊतक५८के बीच बातचीत की जटिलता के बहुत दोहराऊंगा करने के लिए असफल । विशेष रूप से, 2 डी सेल संस्कृति का उपयोग सतह कोटिंग्स के परीक्षण इलेक्ट्रोड ज्यामिति की मॉडलिंग और यांत्रिक बेमेल और micromotion के प्रभाव को एक मेजबान युक्ति विफलता५९ के लिए योगदान देने के लिए योगदान सोचा , ६०.
2 डी सेल संस्कृति से जुड़ी समस्याओं को दूर करने के लिए, तंत्रिका कोशिकाओं की hydrogel संस्कृतियों अनुप्रयोगों की एक विस्तृत विविधता के लिए विकसित किया गया है, औषधीय अध्ययन६१, तंत्रिका कोशिका विभेद६२प्रत्यक्ष करने के लिए, रोग को समझने के लिए रास्ते६३,६४, या मॉडल सेल प्रवास, neuroprotection, या मॉडल ऊतक microenvironments६१के लिए अंय सेल प्रकार के साथ सह संस्कृति में स्तरित । Hydrogels आसानी से विभिंन आकारों में गठित कर रहे है और geometries प्राथमिक या अमर कोशिका संस्कृतियों के कई प्रकार को शामिल कर सकते हैं, और उच्च ऐसे फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में सामांयतः इस्तेमाल किया तकनीकों द्वारा विश्लेषण के लिए उत्तरदाई हैं । glial scarring प्रक्रिया का एक मॉडल बनाने के लिए, हम हाल ही में विकसित किया है और एक hyaluronic एसिड आधारित 3 डी hydrogel प्रणाली glial प्रतिक्रिया के उच्च प्रवाह परीक्षण के लिए प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड (चित्रा 1)६५के लिए विशेषता । इस प्रणाली के कई विशिष्ट लाभ हैं: 1) प्राथमिक glial कोशिकाओं (microglia, astrocytes, और oligodendrocytes) एक 3 डी मैट्रिक्स hyaluronic एसिड, जो एक अंतर्जात extracellular मैट्रिक्स घटक है के पॉलिमर से बना में समझाया जाता है; 2) मैट्रिक्स कठोरता ‘ देखते ‘ हो सकता है मस्तिष्क या रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के यांत्रिक गुणों बहलाना; और 3) कोशिकाओं में मैट्रिक्स में समझाया जा सकता है एक तेजी से बेंच-शीर्ष दृष्टिकोण हरी बत्ती के साथ photopolymerization का उपयोग कर, encapsulation के दौरान विषाक्तता सीमित. इस प्रणाली के प्रमुख विशेषताओं में सक्षम बनाता है vivo reसंगतता: डिवाइस ऊतक के लिए एक तुलनीय तरीके से hydrogel में डाला जाता है, और प्रत्यारोपित उपकरणों के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया मानकों६५की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए निगरानी कर रहे हैं. इन उपकरणों और विभिंन संरचनाओं और बिजली उत्तेजना दालों की hydrogel कोटिंग्स के बीच यांत्रिक बेमेल शामिल हैं । इस सिस्टम में oligodendrocyte और संबंधित पुरोगामी भी शामिल हैं, जो अक्सर मौजूद रहते हैं और glial निशान में भर्ती होते हैं । उनकी क्षति, मृत्यु, और microglia द्वारा phagocytosis भड़काऊ चोट का अत्यधिक संकेत कर रहे हैं और एक मॉडल के रूप में कम scarring या वसूली, वे फिर से प्रदर्शन करने की क्षमता है-न्यूरॉन्स की myelination६६.
साथ ही हम संश्लेषण और संकर hyaluronic एसिड hydrogels के गठन के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तहखाने झिल्ली योगों के साथ संयुक्त के लिए एक विधि का वर्णन सेल निगम में सुधार होगा । इसके अलावा, हम प्राथमिक प्रसंस्कृत glial कोशिकाओं के शामिल (microglia, astrocytes, और oligodendrocytes) और संस्कृति के विकास का विश्लेषण immunocytochemistry और फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर प्रदर्शित करेगा ।
मॉडल glial bioreactivity और glial scarring प्रक्रिया के लिए एक 3d संस्कृति प्रणाली पैदा करने के लक्ष्य की ओर, हम एक प्रणाली है कि प्राथमिक प्रसंस्कृत microglia, astrocytes और oligodendrocytes का समर्थन कर सकते है और सेल के मजबूत लक्षण वर्णन सक्षम बना…
The authors have nothing to disclose.
लेखक NSERC, CFI, AIHS, अलबर्टा स्वास्थ्य सेवाओं, और मस्तिष्क अनुसंधान के लिए Davey बंदोबस्ती से वित्तीय सहायता के लिए आभारी हैं ।
1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization | |||
Hyaluronic acid (HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi, MW: 1.5 – 1.8 X 10^6 |
Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
Ethanol (EtOH) | Commerical Alcohols Inc. | Anhydrous | |
Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets | Fisher Scientific | 18912014 | |
Triethanolamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
EosinY (EY) | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
Beaker (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
Beaker (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
pH paper (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2. Materials for glial cell isolation and cell culture | |||
P1-2 Sprague Dawley rat pups | Charles River | CD Sprague Dawley rat strain code 001 | |
Dissector scissors – slim blades (small) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
Surgical scissors – Toughcut (large) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
Curved fine forceps (Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
Penicillin-streptomycin (PS) | Gibco | 15140-122 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
10 mL serological pipette | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
25 mL serological pipette | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
Petri dish (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Petri dish (100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Microscope Coverslip (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy) | |||
Mouse monoclonal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
Rabbit anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
Chicken anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Buffered (10%) |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
Paraformaldehyde | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | Buffered (8%) |
Guteraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16019 | Buffered (8%) |
Osmium tetraoxide | Electon Microscopy Sciences | 19152 | Buffered (2%) |
Hexamethyldilazane (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
Ethanol (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | Anhydrous |
Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |