여기, 우리는 쥐의 3D 문화에 대 한 프로토콜 이다, microglia, 및 oligodendrocytes를 포함 하 여 두뇌 파생 명과 셀을 제시. 1 차 세포 배양, methacrylated 히 알루 론 산 (하 마) 하이드로 겔 합성, HAMAphoto 중 합 및 셀 캡슐화 및 샘플 공초점 레이저 스캐닝 전자 현미경 이미징 처리 설명 합니다.
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방법 논문
생체 외에서 Neuroinflammation의 모델링에 대 한 기본 Glial 세포의 3 차원 하이드로 겔 문화 개선
이 논문에서
요약
초록
중앙 신경 조직, 수많은 급성 부상 및 신경 장애, 뿐만 아니라 이식 장치 또는 생체 같은 결과에서 함수 결과 향상 시키기 위해 설계: gliosis, 세포 독성, 이끌어 과잉 염증 또는 집합적으로 부상 악화 또는 건강 회복을 방해 glial 흉터 대형. 우리가 3 차원 셀 비 계 기본 교양된 glial 세포 수 있는 모델 glial 흉터 대형 그리고 연구 염증 성 프로세스에 시스템을 만드는의 도와 함께 생성: microglia 이물질 응답을 통제 하 고 시작 하는 염증 성 이벤트, 이다 섬유질 흉터 형성에 응답 하는 및 oligodendrocytes 일반적으로 염증 성 손상에 취약. 현재 작업 방법을 제공 한다는 상세한 단계별 제작, 문화, 및 캡슐화 된 쥐와 히 알루 론 산 기반 3D 히드로 발판의 현미경 특성 두뇌 파생 glial 세포를. 또한, 세포 캡슐화 및 confocal 면역 형광 및 전자 현미경을 스캐닝 하 여 하이드로 겔 비의 특성에 대 한 프로토콜을 보여 줍니다와 생리 활성 기판으로 비 계를 수정 하는 능력 뿐만 아니라 향상 된 셀 통합 상업 기저 lamina 혼합물 설립
서론
중앙 신경 조직 (CNS)의 염증이 오래 고려 되었습니다 급성의 특징 (예:허 혈 성 뇌졸중, 외상 성 뇌, 척수 손상) 및 만성 (예: 알츠하이머병, 파 킨 슨 병의, 그리고 Huntington의 질병) CNS 상해, 하지만 점점 신경 정신병 무질서 하 인과 기여자로 인식 됩니다. 지속 또는 부적 절 한 수 있습니다 신경 상해의 원인과 demyelination (예: 다 발성 경화 증), 염증과 부정적인 영향 (예를 들어, 정신 분열 증, 자폐증) 두뇌 개발 및 기분 상태 (예, 우울증, 불안 양극성 질환). 또한, 새로운 치료 전략을 이식할 수 있는 장치를 사용 하 여 (예., 뇌-컴퓨터 인터페이스1,2,3, 깊은 두뇌 자극4,5, intraspinal microstimulation6,7,
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프로토콜
주 1 Sprague Dawley 쥐 새끼, 잘린에 의해 안락사에서 뇌 조직 추출 프로토콜 동물 관리 및 사용 위원회 앨버타의 대학에 의해 승인 되었다.
1. Microglia 및 사이토 격리67,68
참고: 격리 및 세포 배양에 대 한 모든 미디어는 물 욕조에 37 ° c으로 미리 데워 행 크의 균형된 소금물 (HBSS)는 1% 페니실린-스 (PS). 모든 Dulbecco의 햄의 F12 영양소 혼합 (DMEM/F12) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린-스 (PS) 보충은 글의 미디어를 수정 합니다. 트립 신으로 유일한 혼합물 FBS 부족합니다. 이 프로토콜에서 모든 물질이 살 균 (필터, 알코올, 산, 고 압력가) 고 단계 번호 1.8 이후 모든 단계 biosafety 무 균 기법으로 캐비닛에서 수행 됩니다.
- 뇌, 당 전 15 mL HBSS의 그리고 12.5 mL 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에서 37 ° C에 DMEM/F12 약 2 mL 1 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브....
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결과
신경 조직 호스트 응답 및 높은 처리량 glial 흉터를, 에서 시험관 시스템 생체, 원래의 장소에 형성 하는 동안 세포 독성 이벤트를 초래 하지 않습니다 이며 대 행렬 자료와 3D 셀 비 계 필요 로 자비로 운 응답 가이드 bioactive 구성 요소. 이 위해, 우리 히 알루 론 산에 따라 3D 셀 발판 시스템 하 고 캡슐화 기본 혼합된 glial 세포 인구 세포 세포 상호 작용 및 glial bioreactivity 공부 하. 세포와 발판의 간단한 시각적 연구 수행 되었다. Oligodendrocytes (CNPase 녹색에)를 포함 하 여 셀 부분 모집단의 형태 microglia 빨간색에서 (Iba1), 이다 (노란색에서 GFAP), confocal immunofluorescent 현미경 검사 법 (그림 3Ai-ii-Ci-ii)에 의해 표시 됩니다........
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토론
모델 glial bioreactivity 3 차원 문화 시스템 및 glial 흉터 프로세스 생성의 목표를 향해 우리 셀의 강력한 묘사를 가능 하 게 이다 및 oligodendrocytes 기본 교양된 microglia를 지원할 수 있는 시스템을 개발 했습니다. 형태학 및 세포 세포 상호 작용입니다. 표시 하는 현미경 사진에서 각 셀 형식의 형태학이 달랐다 분명히 2D, 3D-하 마, 그리고 3D 하 마 기저 lamina 혼합 플랫폼. 2D 시스템에서의 표면, 평면 형태 치우친 분명히 있었으나 3D 하 마에 비해 microglia 및 이다 oligodendrocyte 클러스터 제외한 매트릭스 안에 일반적으로 더 작은. 스캐닝 전자 현미경에서 세포 했다 일반적으로 더는 하 마에 둥근 모양. 이것은 크게 운동 및 자유로운 이동 및 프로세스의 성장에 대 한 행렬을 수정 하려면 제한 된 용량으로 캡슐화 되 고 셀 원인일 수 있습니다. 하 마에서 셀 파생물 이다와 oligodendrocytes에 대 한 일반적으로 레이디얼 이었다. 이러한 .......
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공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
저자는 NSERC, CFI, AIHS, 알버타 헬스 서비스, 그리고 뇌 연구를 위한 비 기부금에서 재정 지원에 대 한 감사.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| <강한>1. HAMA 합성 및 광중합을 위한 재료 | |||
| 히알루론산(HA) | 시그마-알드리치 | 53747-10G | 스트렙토코커스 equi, MW: 1.5 - 1.8 X 10^6 |
| 메타크릴 무수물(MA) | 시그마-알드리치 | 275585-100ML | |
| 수산화나트륨(NaOH) | 시그마-알드리치 | 221465-25G | |
| 에탄올(EtOH) | 상업용 알코올 주식회사 | 무수 | |
| 인산염 완충 식염수(pH 7.4) 정제 | Fisher Scientific | 18912014 | |
| 트리에탄올아민(TEA) | 시그마-알드리치 | 90279-100ML | |
| 1-비닐-2피롤리디논(NVP) | 시그마-알드리치 | V3409-5G | |
| EosinY(EY) | 시그마-알드리치 | E6003-25G | |
| 폴리디메틸실록산(PDMS) 실가드 184 실리콘 엘라스토머 키트 | 다우 코닝 | ||
| 3- (트리 메 톡시 실릴) 프로필 메타 크릴 레이트 | 시그마 - 알드리치 | 440159-100ML | |
| 비커 (100mL) | 코닝 | 1000-100 | |
| 비커 (500mL) | 코닝 | 1000-600 | |
| pH 종이 (Labstick) | 시그마 알드리치 | 9580 | |
| < strong>Name< / strong> | < strong>Company | 카탈로그 번호 | 코멘트 |
| 2. 신경교세포 분리 및 세포 배양을 위한 재료 | |||
| P1-2 Sprague Dawley 쥐 새끼 | Charles River | CD Sprague Dawley 쥐 변형 코드 001 | |
| 해부 가위 - 슬림 블레이드(소형) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| 수술용 가위 - Toughcut(대) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| 미세 집게(Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
| 곡선형 미세집게(Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Hank's Balanced Salt solution (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Penicillin-streptomycin (PS) | Gibco | 15140-122 | |
| 소 태아 혈청(FBS) | Gibco | 12483-020 | |
| 0.25% 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
| 폴리-L-라이신(PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
| 50mL 코니컬 원심분리기 튜브 | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 15mL 코니컬 원심분리기 튜브 | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
| 12웰 조직 배양 처리 플레이트(Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
| 10 mL 혈청학 피펫 | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
| 25 mL 혈청학 피 | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
| 페트리 접시 (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| 페트리 접시 ( 100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 현미경 커버슬립 (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
| Name | Company | 카탈로그 번호 | Comments |
| 3. 현미경 (공초점 및 주사 전자 현미경) 용 재료 < / strong> | |||
| Mouse monoclonal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
| Chicken anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
| Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| 포르말린 | 시그마 알드리치 | HT501128-4L | 완충 (10%) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| 호스 세럼 | Gibco | 16050-122 | |
| 파라포름알데히드 | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | 완충(8%) |
| 구테알데히드 | Electon Microscopy Sciences | 16019 | 버퍼링(8%) |
| 사산화오스뮴 | Electon Microscopy Sciences | 19152 | 버퍼(2%) |
| 헥사메틸딜라잔(HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
| 에탄올(EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | 무수 |
| 현미경 슬라이드(25 X 75 X 1mm) | VWR International | 48311-703 |
참고문헌
- Shih, J. J., Krusienski, D. J., Wolpaw, J. R. Brain-Computer Interfaces in Medicine. Mayo Clin. Proc. 87, 268-279 (2012).
- Kennedy, P. R., Bakay, R. A. Restoration of neural output from a paralyzed patient by a direct brain connection. Neuroreport. 9, 1707-1711 (1998....
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재인쇄 및 허가
