생체 외에서 Neuroinflammation의 모델링에 대 한 기본 Glial 세포의 3 차원 하이드로 겔 문화 개선
Summary
여기, 우리는 쥐의 3D 문화에 대 한 프로토콜 이다, microglia, 및 oligodendrocytes를 포함 하 여 두뇌 파생 명과 셀을 제시. 1 차 세포 배양, methacrylated 히 알루 론 산 (하 마) 하이드로 겔 합성, HAMAphoto 중 합 및 셀 캡슐화 및 샘플 공초점 레이저 스캐닝 전자 현미경 이미징 처리 설명 합니다.
Abstract
중앙 신경 조직, 수많은 급성 부상 및 신경 장애, 뿐만 아니라 이식 장치 또는 생체 같은 결과에서 함수 결과 향상 시키기 위해 설계: gliosis, 세포 독성, 이끌어 과잉 염증 또는 집합적으로 부상 악화 또는 건강 회복을 방해 glial 흉터 대형. 우리가 3 차원 셀 비 계 기본 교양된 glial 세포 수 있는 모델 glial 흉터 대형 그리고 연구 염증 성 프로세스에 시스템을 만드는의 도와 함께 생성: microglia 이물질 응답을 통제 하 고 시작 하는 염증 성 이벤트, 이다 섬유질 흉터 형성에 응답 하는 및 oligodendrocytes 일반적으로 염증 성 손상에 취약. 현재 작업 방법을 제공 한다는 상세한 단계별 제작, 문화, 및 캡슐화 된 쥐와 히 알루 론 산 기반 3D 히드로 발판의 현미경 특성 두뇌 파생 glial 세포를. 또한, 세포 캡슐화 및 confocal 면역 형광 및 전자 현미경을 스캐닝 하 여 하이드로 겔 비의 특성에 대 한 프로토콜을 보여 줍니다와 생리 활성 기판으로 비 계를 수정 하는 능력 뿐만 아니라 향상 된 셀 통합 상업 기저 lamina 혼합물 설립
Introduction
중앙 신경 조직 (CNS)의 염증이 오래 고려 되었습니다 급성의 특징 (예:허 혈 성 뇌졸중, 외상 성 뇌, 척수 손상) 및 만성 (예: 알츠하이머병, 파 킨 슨 병의, 그리고 Huntington의 질병) CNS 상해, 하지만 점점 신경 정신병 무질서 하 인과 기여자로 인식 됩니다. 지속 또는 부적 절 한 수 있습니다 신경 상해의 원인과 demyelination (예: 다 발성 경화 증), 염증과 부정적인 영향 (예를 들어, 정신 분열 증, 자폐증) 두뇌 개발 및 기분 상태 (예, 우울증, 불안 양극성 질환). 또한, 새로운 치료 전략을 이식할 수 있는 장치를 사용 하 여 (예., 뇌-컴퓨터 인터페이스1,2,3, 깊은 두뇌 자극4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,,910) 장치 및 CNS에서 결과 사이의 인터페이스에서 예측 가능한 선 동적인 응답을 생성 한 11임 플 란 트 수명에 걸쳐 효능 또는 장치 실패의 손실을 일으킬 수 있는 보호 조직 응답. CNS에 염증은 일반적으로 CNS 조직 감시 및 이물질 응답 (검토12) 장착에 대 한 책임의 거주 면역 세포 기능 microglia에 의해 시작 됩니다. 모욕의 심각도에 따라, microglia 신호 및 모집 추가 부상 사이트 종류 세포. 특히,는 microglia 활성화에 보조 염증 세포 및 양식 부상 사이트13,14를 포함 하는 밀도 보호벽 역할 이다. Microglia 또한 (참조15검토) 면역 침투를 허용 하도록 BBB의 붕괴 귀 착될 수 있다 주변 면역계의 세포에 활동 캐스케이드를 시작할 수 있습니다.
CNS에 이식 하는 장치의 경우 조직을 피해 외국 장치의 지속적인된 존재로 서 장치 삽입 glial 흉터 라고 하는 프로세스를 시작할 수 있습니다. 이 과정에서는 microglia 마이그레이션을 하 고 상해의 사이트에 확산. 그들은 또한 잠재적인 위협을 중화 하 고 모집 추가 glial 세포를 염증 인자의 방출을 시작 합니다. 그 후, 활성화 이다 hypertrophic 되 고 연속 섬유 장벽16이식된 장치를 캡슐화 시작. 염증 신호는 임 플 란 트의 주변에서 신경 프로세스의 철수를 촉진 하는 역할도 하 고 결국 개발 glial 흉터17강화 섬유 아 세포를 신병. Oligodendrocytes, 전도성, 강화 하기 위하여 myelin 신경 세포를 넣는 담당 할 하지이 과정 생존과 먼 셀 플에서 흉터18으로 분할 된다. Glial 흉터 크게 기능과 기록 전극, 특히 이식된 소자의 수명 감소 하 고 궁극적으로 신경 인터페이스19의 기능을 제한 하는 역할.
몇 가지 방법은 생체 적합성 및 CNS20,21,,2223에서 이식 장치 인터페이스 활동 증가 악용 되어 있다. 이러한 신경 인터페이스24의 생체 디자인에 광범위 한 검토를 이용하실 수 있습니다. 가장 눈에 띄는 전략 polyelthyleneglycol (PEG), 공동 glycolic polylactic 산 (PLGA)25, 같은 호환 코팅 전극 주변 또는 강화 폴 리 (에틸렌 등 전도성 폴리머와 전극 포함 dioxythiophene) (PEDOT), polypyrrole (PPy)26,,2728,29,30,31. 생리 활성 코팅 collagens, 히 알루 론 산32,33,34, fibronectins, 등 세포 외 매트릭스에서 파생 하는 ligands를 사용 하 여 신경 조직의 성장에 대 한 단서를 제공 하기 위해 고용 또한 있다 ,35,,3637. 성장 인자 릴리스 시스템을 흉내 낸 자연 세포 분 비 물30,38,39,,4041 이 코팅의 bioactivity 더 탐험 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. 동시에, 일부 연구 그룹 전극 형상, 유연성, 및 구성 장치 및 조직51,52,53 사이 기계적인 불일치 감소을 개장 하기로 ,,5455,,5657. 그러나 이러한 전략 있는 많은 유망 개선 이어질 다음-세대 신경 계면 장치, 장기 호환성에 문제 이며 진행 복잡 하 고 시간이 걸리는 시내 vivo 모델에 의해 방해 받을 수 있습니다. .
동물 모델 기반 접근 실험 처리량을 제한 하 고 전극 생체 적합성 테스트의 비용을 증가 시킬 수 있습니다. 생체 외에서 기존의 세포 배양 기술을 더 비용 효율적인 대안을 제공 하지만 많은 장치 및 조직58사이 상호 작용의 복잡성을 정리 하지를 사용 하 여 접근 한다. 특히, 전극 형상의 모델링 및 기계적 불일치 및 micromotion 장치 오류59 기여 호스트 응답 생성을 생각 영향 문화 제한, 2D 셀을 사용 하 여 표면 코팅의 테스트 , 60.
2 차원 세포 배양과 관련 된 문제를 해결 하려면 신경 세포의 하이드로 겔 문화 개발 되었으며, 다양 한 응용 프로그램, 약리 연구61, 신경 세포 분화62, 질병을 이해 하는 것을 직접 경로63,64또는 다른 세포 유형 모델 셀 마이그레이션, neuroprotection, 또는 모델 조직 microenvironments61층된에 공동 문화. Hydrogels 쉽게 다른 크기로 형성 되 고 형상 기본 또는 불멸 하 게 한 세포 배양의 수많은 종류를 통합할 수 있습니다 매우 공초점 형광 현미경 등 일반적으로 사용 되 기술에 의해 분석을 받을. Glial 흉터 프로세스의 모델을 만들려면, 우리는 최근 개발과 이식된 전극 (그림 1)65glial 응답의 높은 처리량 테스트를 위해 히 알루 론 산 기반된 3 차원 하이드로 겔 시스템 특징. 이 시스템은 여러 가지 이점이 있다: 1) 3 차원 매트릭스 고분자 히 알루 론 산, 생 세포 외 매트릭스 구성;의 구성에서 기본 glial 세포 (microglia, 이다, 및 oligodendrocytes) 캡슐화 2)는 매트릭스 강성 조정 될 수 있다 ” 두뇌 또는 척수 조직;의 기계적 특성을 재현 하 그리고 3) 세포는 빠른 벤치탑 접근 제한 독성 캡슐화 중 녹색 빛으로 photopolymerization를 사용 하 여 매트릭스에 캡슐화 될 수 있습니다. 이 시스템은 생체 내에서 생체 적합성의 주요 기능 수 있습니다: 장치는 하이드로 겔 조직으로, 유사한 방식으로 삽입 되 고 이식된 장치에 세포질 응답은 다양 한 매개 변수65에 대 한 모니터링. 다양 한 구조와 전기 자극 펄스의 하이드로 겔 코팅, 기계 불일치나 장치 포함 됩니다. 이 시스템은 또한 oligodendrocyte 및 자주 존재 하 고 glial 흉터에 채용 관련된 선구자 포함 됩니다. 그들의 손상, 죽음, 그리고 microglia에 의해 식 균 작용은 매우 선 동적인 상해의 지표 그리고 모델 감소 흉터 또는 복구, 그들은 능력을 다시-myelination 뉴런66의 설명.
여기는 합성 및 하이브리드 히 알루 론 산 hydrogels 셀 병합을 개선 하기 위해 상용 지하실 멤브레인 공법으로 결합의 형성 하는 방법에 설명 합니다. 또한, 우리는 기본 교양된 glial 세포 (microglia, 이다, 및 oligodendrocytes)의 설립 및 문화 성장 immunocytochemistry 그리고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 분석을 시연할 예정 이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
모델 glial bioreactivity 3 차원 문화 시스템 및 glial 흉터 프로세스 생성의 목표를 향해 우리 셀의 강력한 묘사를 가능 하 게 이다 및 oligodendrocytes 기본 교양된 microglia를 지원할 수 있는 시스템을 개발 했습니다. 형태학 및 세포 세포 상호 작용입니다. 표시 하는 현미경 사진에서 각 셀 형식의 형태학이 달랐다 분명히 2D, 3D-하 마, 그리고 3D 하 마 기저 lamina 혼합 플랫폼. 2D 시스템에서의 표면, 평면 형태 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 NSERC, CFI, AIHS, 알버타 헬스 서비스, 그리고 뇌 연구를 위한 비 기부금에서 재정 지원에 대 한 감사.
Materials
| 1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization | |||
| Hyaluronic acid (HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi, MW: 1.5 – 1.8 X 10^6 |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Ethanol (EtOH) | Commerical Alcohols Inc. | Anhydrous | |
| Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets | Fisher Scientific | 18912014 | |
| Triethanolamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| 1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
| EosinY (EY) | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
| Beaker (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
| Beaker (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
| pH paper (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Materials for glial cell isolation and cell culture | |||
| P1-2 Sprague Dawley rat pups | Charles River | CD Sprague Dawley rat strain code 001 | |
| Dissector scissors – slim blades (small) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Surgical scissors – Toughcut (large) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
| Curved fine forceps (Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Penicillin-streptomycin (PS) | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
| 12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
| 10 mL serological pipette | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
| 25 mL serological pipette | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
| Petri dish (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri dish (100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Microscope Coverslip (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy) | |||
| Mouse monoclonal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
| Chicken anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
| Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Buffered (10%) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Paraformaldehyde | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | Buffered (8%) |
| Guteraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16019 | Buffered (8%) |
| Osmium tetraoxide | Electon Microscopy Sciences | 19152 | Buffered (2%) |
| Hexamethyldilazane (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
| Ethanol (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | Anhydrous |
| Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |
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