Melhorado o hidrogel 3D culturas de células gliais primárias para In Vitro modelagem de Neuroinflammation
Summary
Neste documento, apresentamos um protocolo para a cultura 3D do rato as células da glia derivado do cérebro, incluindo astrócitos, oligodendrócitos e micróglia. Vamos demonstrar a cultura de células primárias, síntese de hidrogel de ácido hialurônico methacrylated (HAMA), encapsulamento HAMAphoto-polimerização e celular e amostra de processamento de imagem microscópica confocal e varredura de elétrons.
Abstract
No sistema nervoso central, numerosas lesões agudas e doenças neurodegenerativas, bem como implantados dispositivos ou biomateriais projetado para melhorar o resultado da função no mesmo resultado: inflamação em excesso leva à gliose, citotoxicidade, e/ou formação de uma cicatriz glial que coletivamente agravar lesão ou impedir recuperação saudável. Com a intenção de criar um sistema de modelo cicatriz glial formação e estudo de processos inflamatórios, geramos um andaime celular 3D capaz de habitação primárias culturas de células gliais: micróglia que regulam a resposta do corpo estranho e iniciar o evento inflamatório, astrócitos que respondem para formar uma cicatriz fibrosa e oligodendrócitos tipicamente vulneráveis a lesões inflamatórias. O presente trabalho fornece um método passo a passo detalhado para a fabricação, a cultura e a caracterização microscópica de um andaime de hidrogel 3D à base de ácido hialurônico com rato encapsulado derivado do cérebro células gliais. Além disso, os protocolos para a caracterização de encapsulamento de células e o andaime de hidrogel por imunofluorescência confocal e microscopia eletrônica são demonstrados, bem como a capacidade de modificar o andaime com substratos bioativos, com incorporação de uma mistura de lâmina basal comercial para integração melhorada do celular.
Introduction
Inflamação do sistema nervoso central (SNC) tem sido considerada uma marca registrada de aguda (por exemplo, acidente vascular cerebral isquêmico, traumatismo crânio e lesão medular) e crónica (por exemplo, Alzheimer, Parkinson do e doenças de Huntington) lesão do CNS, Mas é cada vez mais reconhecido como um contribuinte causal neurodegenerativas e distúrbios neuropsiquiátricos. Sustentada ou inflamação inadequada pode causar lesões neurológicas e desmielinização (por exemplo, esclerose múltipla) e influenciam negativamente o desenvolvimento do cérebro (por exemplo, esquizofrenia, autismo) e Estados de humor (por exemplo, depressão, ansiedade transtorno bipolar). Além disso, novas estratégias terapêuticas usando dispositivos implantáveis (ex., interfaces cérebro-computador1,2,3, cerebral profunda estimulação4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,9,10) geram uma resposta inflamatória previsível na interface entre o dispositivo e o CNS, resultando em um resposta de tecido protetor que pode causar perda de eficácia ou dispositivo falha durante a vida útil do implante11. Inflamação no SNC é normalmente iniciada por microglia, que funcionam como as células imunes residentes do SNC responsável pela vigilância de tecido e montagem da resposta de corpo estranho (opinião de12). Dependendo da gravidade do insulto, o sinal microglia e recruta adicional de células tipos para um local da lesão. Especificamente, a microglia ativar os astrócitos, que por sua vez atuam como células inflamatórias secundárias e forma uma barreira protetora densa para conter uma lesão local13,14. Microglia também pode iniciar uma cascata de atividade nas células do sistema imunológico periférica, que pode resultar na degradação do BBB para permitir infiltração imune (revista em referência15).
No caso de dispositivos implantados para o CNS, dano tecidual resultante da inserção do dispositivo, bem como a presença contínua do dispositivo estrangeiro pode iniciar um processo denominado cicatrizes gliais. Neste processo, a microglia migrar para e se proliferam no local da lesão. Também iniciam a liberação de fatores inflamatórios para neutralizar ameaças potenciais e recrutar células gliais adicionais. Posteriormente, astrócitos ativados se tornar hipertróficas e começam encapsulando o dispositivo implantado para formar uma barreira fibrosa contínua16. Sinalização inflamatória também serve para promover a retirada de processos neuronais da vizinhança do implante e recrutas eventualmente fibroblastos para reforçar o desenvolvimento de cicatriz glial17. Os oligodendrócitos, responsáveis pela bainha neurônios na mielina para realçar a condutância, não sobreviver a esse processo e células distantes são particionadas do implante por cicatriz18. Cicatrizes gliais grandemente reduz a função e o tempo de vida de dispositivos implantados, particularmente para eléctrodos de gravação e, finalmente, serve para limitar a funcionalidade de interfaces neurais19.
Várias abordagens têm sido exploradas para aumentar a biocompatibilidade e a atividade de interface de dispositivos implantados no CNS21,20,22,23. Uma extensa revisão está disponível no projeto biocompatível destas interfaces neurais24. As estratégias mais proeminentes incluem em torno do eletrodo com revestimentos compatíveis tais como polyelthyleneglycol (PEG), ácidos polilático-co-glicólico (PLGA)25, ou realçando o eléctrodo com polímeros condutores, tais como a poli (etileno dioxythiophene) (PEDOT) e polipirrol (PPA)26,,27,28,29,30,31. Revestimentos bioativos também têm sido empregados para fornecer dicas para o crescimento de tecido neural usando ligantes derivados de matrizes extracelulares, incluindo colagénios, fibronectins e ácidos hialurônico32,33,34 ,35,36,37. A bioatividade destes revestimentos tem sido mais explorada com sistemas de lançamento de fator de crescimento para emular a célula natural secreções30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. simultaneamente, alguns grupos de pesquisa optou por remodelar a geometria do eletrodo, flexibilidade e composição para diminuir a mecânica incompatibilidade entre o dispositivo e tecido51,52,53 ,54,55,56,57. No total, estas estratégias levaram a muitas melhorias promissoras na próxima geração de aparelhos interfacial neural, no entanto a compatibilidade a longo prazo é uma questão em andamento e progresso pode ser prejudicado por modelos complexos e demorados em vivo .
Abordagens baseadas em modelo animais podem limitar a taxa de transferência experimental e aumentar os custos dos testes de biocompatibilidade do eletrodo. In vitro se aproxima usando cultura de células convencional técnicas oferecem uma alternativa mais econômica, mas não conseguem muito da complexidade da interação entre o dispositivo e tecido58recapitular. Em particular, ensaios de revestimentos de superfície usando limites de cultura celular 2D a modelagem da geometria do eletrodo e a influência de incompatibilidade mecânica e micromovimentos pensados para contribuir para gerar uma resposta do hospedeiro contribuindo para dispositivo falha59 , 60.
Para superar os problemas associados com a cultura de pilha 2D, hidrogel culturas de células neurais têm sido desenvolvidas para uma ampla variedade de aplicações, estudos farmacológicos61, para direcionar a diferenciação celular neural62, para entender a doença vias63,64, ou em camadas em co-cultura com outros tipos de células para a migração celular de modelo, neuroproteção, ou modelo tecido microambiente61. Hidrogel formam-se facilmente em diferentes tamanhos e geometrias podem incorporar vários tipos de culturas de células primárias ou imortalizado e são altamente passíveis de análise por técnicas comumente usadas, tais como a microscopia de fluorescência confocal. Para criar um modelo do processo cicatricial glia, recentemente desenvolvemos e caracteriza-se um sistema de hidrogel 3D com base de ácido hialurônico para testes de alto rendimento da glia resposta para eletrodos implantados (Figura 1)65. Este sistema tem várias vantagens distintas: 1) principais células da glia (oligodendrócitos, astrócitos e microglia) são encapsuladas em uma matriz 3D composta por polímeros de ácido hialurônico, que é um componente da matriz extracelular endógena; 2) a rigidez da matriz pode ser ‘afinada’ para recriar as propriedades mecânicas do cérebro ou da medula espinhal, tecido; e 3) células podem ser encapsuladas na matriz em uma aproximação rápida de bancada usando fotopolimerização com luz verde, limitando a toxicidade durante o encapsulamento. Este sistema permite características de biocompatibilidade em vivo : dispositivos são inseridos o hidrogel de forma comparável ao tecido, e a resposta celular a dispositivos implantados são monitorados para uma ampla gama de parâmetros65. Estes incluem mecânica incompatibilidade entre os dispositivos e os revestimentos de hidrogel de várias estruturas e pulsos de estimulação elétrica. Este sistema também inclui oligodendrocyte e precursores relacionados, que muitas vezes são recrutados em cicatrizes gliais e presentes. Seus danos, morte e fagocitose por microglia são altamente indicativos de lesão inflamatória e como um modelo reduzido de cicatrizes ou recuperação, eles têm a capacidade de demonstrar re-mielinização dos neurônios66.
Neste documento descrevemos um método para a síntese e a formação de hidrogel de ácido hialurônico híbrido combinado com formulações disponíveis comercialmente membrana basal para melhorar a incorporação de célula. Além disso, demonstraremos a incorporação de culturas de células gliais primárias (oligodendrócitos, astrócitos e microglia) e análise de crescimento de cultura usando imunocitoquímica e microscopia confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Com o objectivo de gerar um sistema de cultura 3D para modelo bioreactivity gliais e o processo de cicatrização glia, nós desenvolvemos um sistema que pode oferecer suporte primário microglia culta, astrócitos e oligodendrócitos e permite a caracterização robusta de célula interações morfologia e célula-célula. Das micrografias mostradas, a morfologia de cada tipo de célula foi distintamente diferente com plataformas de mistura lâmina HAMA-Basal de 2D, 3D-HAMA e 3D. No sistema 2D, morfologia distintamente …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores estão gratos pelo apoio financeiro do NSERC, CFI, AIHS, serviços de saúde de Alberta e a doação de Davey para a pesquisa do cérebro.
Materials
| 1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization | |||
| Hyaluronic acid (HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi, MW: 1.5 – 1.8 X 10^6 |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Ethanol (EtOH) | Commerical Alcohols Inc. | Anhydrous | |
| Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets | Fisher Scientific | 18912014 | |
| Triethanolamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| 1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
| EosinY (EY) | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
| Beaker (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
| Beaker (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
| pH paper (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Materials for glial cell isolation and cell culture | |||
| P1-2 Sprague Dawley rat pups | Charles River | CD Sprague Dawley rat strain code 001 | |
| Dissector scissors – slim blades (small) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Surgical scissors – Toughcut (large) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
| Curved fine forceps (Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Penicillin-streptomycin (PS) | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
| 12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
| 10 mL serological pipette | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
| 25 mL serological pipette | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
| Petri dish (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri dish (100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Microscope Coverslip (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy) | |||
| Mouse monoclonal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
| Chicken anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
| Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Buffered (10%) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Paraformaldehyde | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | Buffered (8%) |
| Guteraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16019 | Buffered (8%) |
| Osmium tetraoxide | Electon Microscopy Sciences | 19152 | Buffered (2%) |
| Hexamethyldilazane (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
| Ethanol (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | Anhydrous |
| Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |
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