مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1 لتحليل تكوين وإصلاح الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل
Summary
هذه المخطوطة يوفر بروتوكول لتحليل الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1.
Abstract
فواصل مزدوجة-حبلا الحمض النووي (جهاز تسوية المنازعات) خطيرة الحمض النووي آفات. تحليل لتشكيل وإصلاح جهاز تسوية المنازعات ذات الصلة بطائفة واسعة من مجالات البحوث بما في ذلك سلامة الجينوم وسمية جينية وبيولوجيا الإشعاع، والشيخوخة، والسرطان وتطوير العقاقير. ردا على جهاز تسوية المنازعات، هو فوسفوريلاتيد هيستون H2AX 139 سيرين في منطقة من مناطق عدة أزواج ميجاباسي تشكيل بؤر النووية منفصلة يمكن كشفها بالفحص المجهري الفلورة. وبالإضافة إلى ذلك، 53BP1 (البروتين p53 1) آخر بروتين المراعية لجهاز تسوية المنازعات الهامة تعزيز إصلاح جهاز تسوية المنازعات قبل نونهومولوجوس الانضمام إلى نهاية بينما تمنع جزئ مثلى. وفقا للمهام المحددة في γH2AX و 53BP1، قد يكون الجمع بين تحليل γH2AX و 53BP1 بالفحص المجهري الفلورة نهجاً معقولاً لإجراء تحليل مفصل لجهاز تسوية المنازعات. وتوفر هذه المخطوطة بروتوكول خطوة بخطوة وتستكمل مع ملاحظات منهجية لأداء التقنية. على وجه التحديد، يتضح تأثير دورة الخلية في أنماط البؤر γH2AX الليفية العادي الخط الخلية نهدف. علاوة على ذلك، يبين قيمة البؤر γH2AX كالعلامات البيولوجية لمفاوية المشع بالأشعة السينية لشخص سليم. وأخيراً، عدم الاستقرار الوراثي هو التحقيق في CD34 + خلايا المريض بسرطان الدم النقوي الحاد مجهرية الفلورة γH2AX و 53BP1.
Introduction
تلف الحمض النووي بشكل مستمر بالذاتية (مثلاً، الإجهاد النسخ المتماثل، الأنواع الأكسجين التفاعلية، وعدم استقرار جوهري للحمض النووي) وخارجية (مثلاً، الجذور الكيميائية، والتشعيع) مصادر (الشكل 1)1،2 ،،من34. بين الأضرار الحمض النووي، والحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل (جهاز تسوية المنازعات) آفات خطيرة بصفة خاصة وقد تؤدي إلى موت الخلايا أو التسرطن. وقد تنشأ حوالي 50 جهاز تسوية المنازعات كل خلية ودورة الخلية5. في خلايا الثدييات، وضع جزئ المتجانسة (الموارد البشرية) ونونهومولوجوس نهاية-الالتحاق بالعمل (نج) كمسارات رئيسية لإصلاح جهاز تسوية المنازعات (الشكل 2). الموارد البشرية يحدث في أواخر المرحلة S/G2 ويستخدم أخت سليمة تشروماتيد كقالب لإصلاح يحتمل أن تكون خالية من الأخطاء. وبالمقارنة، نج نشطة في جميع أنحاء دورة الخلية، ويحتمل أن تكون مطفرة كما يمكن إضافة زوج قاعدي أو مستأصل قبل ربط نهايات مكسورة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تمارس من الانضمام إلى نهاية بديلة كآلية بطيئة مطفرة إصلاح احتياطية في حالة عوز نهيج6،7.
حمل جهاز تسوية المنازعات الفسفرة هيستون H2AX 139 سيرين في منطقة من مناطق عدة أزواج مجباس حول كل جهاز تسوية المنازعات. البؤر النووية تشكل تسمى البؤر γH2AX ويمكن كشفها ب الفحص المجهري الفلورة8. ΓH2AX تشجع توظيف المزيد من البروتينات المراعية لجهاز تسوية المنازعات، وهو يشارك في الكروماتين يعيد البناء وإصلاح الحمض النووي، والإشارات تنبيغ9. كما يعتبر كل بؤرة γH2AX لتمثيل هيئة تسوية المنازعات واحد، التحديد الكمي لجهاز تسوية المنازعات مجهر الفلورة من الممكن، الذي أثبت في خطوط خلايا السرطان وعينات المرضى10،11، 12 , 13 , 14-53BP1 (البروتين p53 1) بروتين رئيسي آخر في التوسط لإصلاح جهاز تسوية المنازعات. أنها تشارك في تجنيد المراعية لجهاز تسوية المنازعات البروتينات، مما يشير إلى نقطة تفتيش، وتشابك جهاز تسوية المنازعات تنتهي15. وبالإضافة إلى ذلك، 53BP1 يلعب دوراً حاسما في اختيار مسار إصلاح جهاز تسوية المنازعات. فإنه بتشغيل إصلاح جهاز تسوية المنازعات نحو نج بينما منعت16ساعة. قد يكون التحليل المتزامن ل γH2AX و 53BP1 بالفحص المجهري الفلورة نظراً لمهام حقيقية γH2AX و 53BP1 في إصلاح جهاز تسوية المنازعات، وسيلة مفيدة لتحليل دقيق لتشكيل وإصلاح جهاز تسوية المنازعات.
هذه المخطوطة يوفر بروتوكول خطوة بخطوة لإجراء الفحص المجهري الفلورة γH2AX و 53BP1 في نواة الخلية. على وجه التحديد، يتم تطبيق التقنية في الخلايا الليفية العادي الخط الخلية نهدف، في الأشعة السينية المشع لمفاوية فرد صحية وفي CD34 + خلايا المريض بسرطان الدم النقوي الحاد. تفاصيل الأسلوب هي أشارت في سياق النتائج المعروضة.
Protocol
Representative Results
Discussion
مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1 طريقة مفيدة لتحليل تكوين وإصلاح جهاز تسوية المنازعات في نطاق عريض من المجالات البحثية. معلمات الحرجة التي تؤثر على نتائج هذه التجارب هي مرحلة دورة الخلية، العوامل المستخدمة لتثبيت و permeabilization للخلايا، والاختيار من الأجسام المضادة، والأجهزة والبرمجيات من المجهر الأ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد المشروع “الألماني خوسيه كاريراس اللوكيميا المؤسسة” (14 دجكلس R/2017).
Materials
| RPMI medium | Sigma-Aldrich | R0883 | Medium for cell culture |
| Heparin sodium | ratiopharm | PZN 3029843 | Heparin 5,000 I.U. / mL |
| Sodium chloride solution 0.9% | B. Braun | PZN 1957154 | Component of the anticoagulant stock solution |
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-02 | Medium for isolation of mononuclear cells |
| Trypsin solution 10X | Sigma-Aldrich | 59427C | Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture |
| CD34 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells |
| Diagnostic microscope slides | Thermo Scientific | ER-203B-CE24 | Microscope slides |
| Megafuge 1.0 R | Heraeus | 75003060 | Tabletop centrifuge |
| Cytospin device | |||
| Lid | Heraeus | 76003422 | Lid for working without micro-tubes |
| Cyto container | Heraeus | 75003416 | Cyto container with 2 conical bores |
| Clip carrier | Heraeus | 75003414 | Carrier for holding a cyto container and a slide |
| Support insert | Heraeus | 75003417 | Support insert for holding a clip carrier |
| Triton X-100 (Octoxinol 9) | Thermo Scientific | 85112 | Detergent for permeabilization of cell membranes |
| Potassium hydroxide solution 1M | Merck Millipore | 109107 | Necessary for preparing the paraformaldehyde solution |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixation agent |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Balanced salt solution |
| Chemiblocker | Merck Millipore | 2170 | Blocking agent |
| Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301) | Merck Millipore | 05-636 | Primary antibody for detection of γH2AX |
| Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304) | Novus Biologicals | NB100-304 | Primary antibody for detection of 53BP1 |
| Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody | Invitrogen | A-11001 | Secondary antibody |
| Alexa Fluor 555-conjugated goat anti-rabbit antibody | Invitrogen | A-21428 | Secondary antibody |
| Vectashield mounting medium | Vector Laboratories | H-1200 | Contains DAPI for staining of DNA |
| Axio Scope.A1 | Zeiss | 490035 | Fluorescence microscope |
| Cool Cube 1 CCD camera | Metasystems | H-0310-010-MS | Camera system for digital recording |
| Isis software | Metasystems | Not applicable | Microscope software |
References
- Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Zeman, M. K., Cimprich, K. A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).
- . Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture Available from: https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf (1994)
- Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).
- Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).
- Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70. Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Scully, R., Xie, A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).
- Walters, D. K., et al. Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX. Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).
- Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).
- Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence. Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).
- Chen, E., et al. JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).
- Popp, H. D., et al. Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Leuk Res. 57, 112-118 (2017).
- Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).
- Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
- Boyum, A. Separation of White Blood Cells. Nature. 204, 793-794 (1964).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
- Bain, B., Pshyk, K. Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).
- Popp, H. D., et al. Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology. Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).
- Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
- Lobrich, M., et al. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
- Rothkamm, K., Lobrich, M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).
