このプロトコルでは、カスタマイズされた 3 D プリントのプラスチック金型を使用して可変サイズの自己生成組織リングを製造するためのプラットフォームについて説明します。3 D プリントされた鋳型の硬化 PDMS ネガアガロースは硬化の PDMS ネガのキャストになります。セルがどこ彼らは組織リングに集計結果の agarose 井戸にシードされます。
設計組織は、組織の修復と交換、臨床的に使用されているし、薬剤のスクリーニングおよびひと疾患モデリングのためのツールとして開発されています。自己生成組織拡張行列蒸着、強度、機能などの足場に基づく組織工学上の利点を提供しています。ただし、セルをオンまたはサポート足場内をシードせず三次元組織を製造するためのほとんどの使用可能なメソッドがありません。以前は、非接着剤 agarose の井戸に細胞を播くことによって自己生成組織リングを製造するためのシステムを開発しました。ポリジメチルシロキサン (PDMS) 否定的な最初加工ポリカーボネート金型で鋳造されていた、アガロースはリング状の細胞播種井戸を作成する負 PDMS でゲル化し。ただし、このアプローチの多様性は、ポリカーボネート製金型の加工に使用できるツールの解像度によって限られました。ここでは、PDMS のネガを作製する加工のポリカーボネートの代替として 3 D プリントされたプラスチックが使えると紹介します。3 D プリントされた金型や改訂された金型設計は使いやすく、安価で生産するよく播いたセルあたり、大幅に少ないアガロースと PDMS を必要とし、。我々 は、さまざまな異なる種類の細胞からカスタマイズされた直径の自己生成組織のリングを作成する結果として得られるアガロース井戸を使えることを実証しました。リングは、機械的、機能的で、組織学的解析のためまたはより大きくより複雑な管状組織を製造するために、使用できます。
携帯電話自己組織血管を製造へのアプローチ、足場ベースのアプローチに代わるです。自己組織化、スキャフォールド フリー組織があります大きい細胞密度・強化されたマトリックス析出と強度・足場ベースの組織1,2,3,4 に比べて生物学的機能の改善.ただし、特定のサイズと形状の外因性足場サポートを使用せず 3 D ティッシュを形作る課題のまま。このプロセスは時間のかかり、労働集約的な5をすることができますが、いくつかの方法は、厚い構造を形成する細胞シートの層を融合します。セルすることができます非接着剤型にシードし、許可する代わりに、回転楕円体、リング、および他の組織の形の6,7,の8に集計します。
自己生成組織リング必要より少ない細胞、培養時間の短縮と以下の試薬がより大きな鋼管設計組織しますが、まだ機械的にテスト、病理検査使用したりできる収縮性およびその他の機能テスト7,9,10,11. ティッシュ リング文化パラメーターの数が多いをスクリーニングに最適です、病モデル11として使用するための潜在性または薬剤のスクリーニングの12のツールがあるので急速に作製し、簡単にテストできます。さらに、血管や気管7,13など複雑な組織構造に融合されるリングとリングが回転楕円体14,15など他の図形よりも完全にヒューズがあります。
アガロースは、生体適合性、透水性、非細胞接着性などの自己組織を製造するための金型材として広く使用されます。たとえば、Norotteらは agarose 金型から押出棒、金型の形状や必要な専門機器15限られた制御が有効になってを作製しました。Tanらは、さまざまな図形 (ピラミッド、広場)16のカスタム ハイドロゲル金型を作製する単位の構築としてアルギン酸液滴を堆積させた。しかし、アルギン酸の回転楕円体 (300 μ m) の大口径は、低解像度の機能につながった。このような低解像度凹凸金型の表面セル集約の一貫性に悪影響を及ぼす可能性があります。また、アガロースは、滑らかな機能と特定の寸法6,7,17非接着剤金型を作成する高分子ネガにキャストできます。
以前、我々 は粉砕されたポリカーボネート型7,18PDMS 負キャストからカスタム環状 agarose 細胞播種井戸を製造するシステムを報告しました。アガロースは、PDMS 負に注ぎ、7、18を設定するを許可します。セルに播種したアガロース井戸、彼らの自己のフォームに集計、24 h7,18未満で足場無料ティッシュ リング。PDMS ネガ オートクレーブ、何度も再利用できる、ソフトで柔軟な凝固 agarose 井戸を削除する簡単です。このシステムが Gwytherらで最初に報告されたとき7PDMS のネガから投げ込まれたポリカーボネート型 (図 1 a) を粉砕します。Agarose 鋳造後、細胞播種井戸が個別にカットし、12 ウェル プレート7,18の井戸に入れる.デザインは、単一の agarose 金型 5 リングを生成する適応力 6 ウェル プレート、個々 の井戸をカットする必要がある、PDMS の agarose (図 1 b) 各リングを生成するために必要な量を減らすのも、最近では変更されました。シード トラフ幅より小さいセルは、リングの形成を達成するために必要なシードのセルの数を減らすために使用されました。これらの変更にもかかわらず解像度と型のカスタマイズが使用可能な標準エンドミル寸法に制限されていました、マイクロミは法外に高価にすることができます。さらに、時間がかかるすることができますコンピューター数値制御 (CNC) 加工との時間を予約する必要があるのため面倒な重く利用装置のカスタマイズ、追加計算機援用製造 (CAM)、コンピューター援用設計 (を変換するソフトウェアプログラム可能なツールパスと加工中にポリカーボネート部分の信頼性の高い治具を CAD) ファイル。
本研究では CNC 加工の代替として 3 D プリントの使用を検討しました。足場材料を製造、エンジニア リングのカスタム インプラントと細胞や組織スフェロイド15,19,20の直接印刷、3 D 印刷は使用されています。我々 は高解像度 3 D プリンターを使用し、特殊な 3 D 滑らかなモールドを印刷する私たちを有効に材料を印刷、光沢のある表面仕上げ (材料の表を参照してください)。私たちの技術は、PDMS ネガやアガロース井戸を鋳造に使用することができます高度なカスタマイズ、高解像度のプラスチック金型の製造のためことができます。設計イテレーションを図 1にまとめます。金型設計は金型の 3 D プリントから両方 PDMS ネガと PDMS のネガからアガロース井戸の除去を容易にするためテーパーの外側の壁と中央の穴を含むように金型の 3 D プリント バージョンでさらに変更されました。これらのテーパ機能は、標準加工では実現できません。井戸の底から型の底までの距離は、アガロースよく削除中に速報記事のリスクを軽減する記事の下基本厚い agarose の結果、この繰り返しで増加しました。図 2に模式的リングと金型作製手順を示します。
ここで我々 は、3 D プリントを使用して簡単にカスタマイズされた寸法と多彩な自己生成組織リングの迅速作製法を提案しました。本手法は、Svoronosらの報告に似ています。6, 3 D プリントされたハニカムと犬骨状のワックス金型が PDMS ネガをキャストに使用されました。ただし、金型はいくつかのユニークなデザイン機能を含むように変更されています。ノッチ (図 4 a(1)) では、各リング ラベル付けされ個別に監視できるように金型の向きを提供します。中央の穴 (図 4 a(2))、井戸に媒体の拡散を改善に役立ちます。CAD ファイルの番号は、鋳型に直接印刷します。したがって、PDMS のネガがそれぞれバージョン番号付け、ポスト直径 (図 4A3)。よく谷 (図 3(2)45 °)、および中央の穴 (図 3(3)、5 °) の上部、外側のテーパー壁 (図 3(1), 5 °) は、3 D プリントされた金型から PDMS ネガを除去を容易に、アガロース井戸が PDMS ネガから削除しやすい (図 4 a(2) A(4))。
様々 な直径や細胞の種類、プライマリのひと平滑筋細胞 (SMCs)18,22, ラット大動脈平滑筋細胞の7を含む自己組み立てられたリング状組織をでっち上げることによってこのシステムの汎用性を示しています。,23、ヒト間葉系幹細胞 (hMSCs)13、および平滑筋細胞由来の誘導多能性幹細胞 (Ips)11 (表 1)。進行中の作業では内皮細胞など追加のセル型からリングの形成を評価し、気管内の潜在的なアプリケーションの様々 なサイズの軟骨リングを融合します。完全に細胞構造に加えて、株式会社クロスリンク ゼラチン球13,22リングを作製するはこのシステムが使用されます。微粒子は追加の機械的強度を提供するために自己組織中にリング内で組み込むことができるまたはローカライズされて成長因子13,22の配信。
ティッシュ リングを作製、細胞数の最適化が異なる種類の細胞に必要なあります。サイズと細胞のタイプに応じて最小セル番号が異なる場合があります。Ips から派生した hSMCs は 600,000 セル/リング11播かれるなど、hMSCs と主な hSMCs は 400,000 セル/リング13,22、およびラット大動脈平滑筋細胞は、500,000 のセル/リング18シードで播かれます。リング形成とリング形成24に必要なセルの最小数がトラフ寸法もあります。人間の細胞と 3 D プリントされた金型の研究、トラフ幅 2 mm 使用しています。オリジナルのポリカーボネート製金型は、750,000 hSMCs 2 mm セル リング18を形成するために必要な 3.75 mm のトラフ幅を持っていた。減少トラフ幅リング25あたり 400,000 セル、46% リングの形成に必要な細胞数を減少させることができました。リングあたりに播種された細胞の量を表 1にまとめます。
3 D プリントの材料を選択すると、多くの要因と見なされる必要があります。3 D 印刷素材が十分に高いを持っている必要がありますので PDMS、通常 60 ° C で硬化させる、PDMS 硬化時に損傷を避けるために融点。本研究で使用される材料の融点 (独自の材料材料の表を参照してください) は使用できません。ただし、1 h 60 ° C で焼いたときは、材料が匂いを作り出し始めたことを観測しました。したがって、50 ° C に温度を下げるし、3 D 印刷素材を損なうことがなく、PDMS を焼くために硬化時間を長くことにしました。硬化時間の調整は、金型のフォームより大きい PDMS ネガに変更されている場合は必要かもしれません。3 D プリントされた金型から PDMS 除去後の 60 ° C で追加養生期間は、残りの 3 D プリントされた金型にさらされる温度を抑えながら、粘着性から負最終 PDMS を防ぎます。いくつかの材料が PDMS の硬化を抑制することに注意してください、選択したマテリアルが PDMS と互換性があるようにします。最後に、金型材料の毒性も考慮する必要があります。3 D プリントされた金型はできません細胞と直接接触が、金型からいくつかの残基は、硬化処理中に負の PDMS に譲渡することが不可能です。非常に徹底的な洗濯洗剤が負の PDMS から任意の残基を削除するための十分な分かった.ただし、PDMS の負の数の使用の最初の agarose 井戸の貧しいリング形成に不十分な洗浄が主導を以前見ました。他の 3 D プリントされた材料から PDMS キャストの使用は、洗剤が任意の潜在的な浸出水を含む金型の残基を削除するための十分なことを確認する追加の調査を必要があります。定期テストは必要として、時間をかけて金型を損傷し、繰り返し使用後の残基の増加を引き起こす可能性があります加熱 (50 ° C) にもサイクルを繰り返すこともあります。日には、ティッシュ リングを正常に生成するために使用されている 30 以上の PDMS ネガを生成する単一の 3 D プリントされた金型を使いました。
全体としては、3 D 印刷では、ポリカーボネートの加工より agarose 金型作製のための大きい多様性をことができます。ツーリングと可能であるよりも高い解像度を提供し、金型設計が利用できるツールの大きさによる制限はありません。これによりより柔軟なカスタマイズ、および先を細くなどの機能の追加と加工できない場合があります。このシステムは、リング6,17に加えて他の図形だけでなく、自己組織を加工に適用可能性があります。リングの製造方法を使用して、さまざまなセルタイプおよび気管組織工学13、人工血管7、およびモデリング血管疾患11の潜在的なアプリケーションのためのサイズからティッシュ リングを開発しました。
The authors have nothing to disclose.
感謝博士エリカ スタルツ (学術研究・科学者アプリケーション、WPI 情報技術サービス) の彼女の援助 3 d 印刷、金型設計に彼らの入力について、カレン レヴィ、クリス Nycz アマンダ Zoë Reidinger 博士修士キャシー Suqui、金型設計をテストの支援ジェニファー ・ マンとマイケル ・ オキーフ撮影して彼の支援のため。 この作品は、NSF IGERT DGE 1144804 (MWR、HAS)、NIH R15 HL097332 によって支えられた MWR (TAH)、NSF REU EEC0754996 (BA)、NIH 1R01 EB023907 (MWR、HAS) と NIH R15 HL137197 (MWR、HAS)。
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50040 | |
PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
DMEM | Corning Cellgro | 15-017-CV | |
VeroWhite | StrataSys | RGD835 | |
3D printer | StrataSys | Objet 260 Connex | |
DMEM | Corning Cellgro | 15-017-CV | |
FBS | Thermo Fisher | 16000069 | |
L-glutamine | Corning Cellgro | 25-015-CI | |
Non-essential amino acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
Sodium pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
Pen-strep | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
Trypsin | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | |
PBS | Lonza | 17-516F | |
6-well plate | Corning | 353046 | |
WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells | Provided by T. Wight [ref 21] | N/A |