הבליעה של פלורסנט, חלקיקים מגנטיים לקביעת יכולת ספיגת הנוזלים חרקים
Summary
האכלה נוזל חרקים יש את היכולת לרכוש כמויות הנוזלים משטחים נקבוביים דקה. פרוטוקול זה מתאר שיטה לקביעת ישירות את היכולת של חרקים לבלוע הנוזלים משטחים נקבוביים באמצעות פתרונות הזנה עם חלקיקים פלורסנט, מגנטי.
Abstract
האכלה נוזל חרקים להבלע מגוון של נוזלים, אשר נמצאים בסביבה כמו בריכות, סרטים, או נכלאים נקבוביות קטנות. מחקרים של רכישת נוזלי לדרוש הערכת היחסים מבנה ותפקוד mouthpart; עם זאת, מנגנון ספיגת נוזלים הם היסטורית להסיק מן התצפיות של אדריכלות מבנית, לפעמים ללא ליווי עם ראיות. כאן, אנו מדווחים על שיטה להערכת יכולות ספיגת הנוזלים עם פרפרים (פרפראים) וזבובים (Diptera) באמצעות כמויות קטנות של נוזלים. חרקים ניזונים מ- 20% סוכרוז פתרון מעורבב עם חלקיקים פלורסנט, מגנטי של מסנן ניירות בגדלים נקבובית ספציפיים. החיתוך (המבנה הפנימי משמש לאחסון נוזלים) להסיר את החרק, מניחים על מיקרוסקופ קונפוקלי. מגנט הוא נופף מאת החיתוך כדי לקבוע הנוכחות של חלקיקים, אשר מציינות אם החרקים מסוגלים לבלוע נוזלים. מתודולוגיה זו משמשת כדי לחשוף נרחבת האכלה מנגנון (נימיות ויצירת גשר נוזלי) שעשוי להיות משותף בין פרפראים Diptera בעת האכלה משטחים נקבוביים. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה זו עבור מחקרים של האכלה מנגנונים בין מגוון רחב של חרקים האכלה נוזל, כולל אלה חשוב העברת מחלות, ביומימטיקה מחקרים אחרים שעלולים המערבות תעלות או מיקרו-בגודל ננו איפה תחבורה נוזלי מחייב אימות.
Introduction
הרבה קבוצות החרקים יש mouthparts (proboscises) מותאם ניזון נוזלים, כגון צוף, נרקב פרי, sap זורם (למשל Diptera1, פרפראים2, דבוראים3), עצה (פשפשאים4), דמעות (פרפראים 5), ודם (Phthiraptera6, Siphonaptera7, Diptera7, פשפשאים8, פרפראים9). היכולת של חרקים ניזונים נוזלים רלוונטית בריאות המערכת האקולוגית (למשל האבקה10), מחלת שידור4,11,2,biodiversification12, מחקרים אבולוציה מתכנסת13. למרות המגוון הרחב של מקורות המזון, ערכת נושא בין חרקים מסויימים האכלה נוזל היא היכולת לרכוש כמויות קטנות של נוזלים, אשר יכול להיות מבודד טיפות מיקרו – או בגודל ננו, סרטים נוזלי או משטחים נקבוביים.
לאור המגוון הנרחב של חרקים האכלה נוזל (יותר מ 20% של כל מיני בעלי חיים14,15) ואת יכולתם להאכיל על מגוון של מקורות המזון, הבנה ההזנה שלהם התנהגויות ומנגנונים ספיגת הנוזלים הוא חשוב בתחומים רבים. Mouthpart חרק פונקציונליות, למשל, מילא תפקיד בפיתוח של טכנולוגיה ביונים, למשל, microfluidic מכשירים המסוגלים לבצע משימות כגון הרכישה של כמויות קטנות של נוזלים בשיטות דומות לאלו המועסקים על ידי חרקים16. בעיה יסודית במחקרים של מנגנונים ספיגת נוזלים, עם זאת, לקבוע לא רק כמה חרקים ניזונים נוזלים, אבל השגת ראיות התומך את המנגנון. אך ורק באמצעות התנהגות (למשל, חיטוט עם ה12,חוטם17) כפי מחוון האכלה אינה מספיקה, כי זה לא מאשרת את ספיגת נוזלים מוצלחת, ואינה מספקת אמצעי כדי לקבוע את הנתיב זה נוזלים נסיעות כפי שהם עוברים החרק. בנוסף, ביצוע ניסויים עם כמויות קטנות של נוזלים יותר מייצג טבעי תרחישים האכלה איפה נוזלים2,הגבלת משאבים12.
רנטגן שלב ניגודיות הדמיה נעשה שימוש עם פרפר המונרך (plexippus דאנאוס ל’) כדי להעריך כמה פרפרים ניזונים כמויות קטנות של נוזלים בין משטחים נקבוביים12. פרפרים המונרך השימוש נימיות באמצעות רווחים בין תחזיות cuticular (legulae הגבי) לאורך החדק להביא הנוזלים נכלאים נקבוביות קטנות לתוך התעלה מזון. הנוזלים נכנסות בצורת סרט על הקיר תעלת המזון גדל והוא מתמוטט לתוך גשר נוזלי על ידי מישור אי יציבות12,18, אשר מועבר מכן כדי הבטן הפרפר על ידי פעולה של המשאבה יניקה בראש. למרות רנטגן שלב ניגודיות הדמיה הוא כלי מעולה להמחשת זרימת נוזל בתוך חרקים12,19,20,21, הטכניקה אינה זמינה יותר ונוח השיטה יש צורך עבור הערכה מהירה של יכולת ספיגת הנוזלים של חרק, לבלוע אותם.
כדי לקבוע אם מנגנון האכילה plexippus ד מחיל פרפראים אחרים וגם כדי זבובים (Diptera) (שתי קבוצות ניזונים נוזלים מן משטחים נקבוביים), Lehnert. et al. 13 ליישם טכניקה להערכת היכולת של חרק לאכול כמויות קטנות של נוזלים מן משטחים נקבוביים, אשר מדווח בהרחבה כאן. אמנם הפרוטוקול שמפורטות כאן מחקרים המשתמשים שנרטבו, משטחים נקבוביים, ניתן לשנות את המתודולוגיה ללימודים אחרים, כגון אלה כתובות מנגנונים האכלה בבריכת. בנוסף, להרחיב היישומים בתחומים אחרים, כולל מיקרופלואידיקה וטכנולוגיית bioinspired.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mouthpart חרק פונקציונליות מבחינה היסטורית היא להסיק מחקרים של מורפולוגיה ברוטו (למשל., חוטם lepidopteran פונקציונליות הקשורים קש25,שתייה26); עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה המשלבים ראיות גרמו שינוי פרדיגמה בהבנתנו המורכבות של חרקים mouthparts, מבנה פונקציה יחסים<sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית (NSF) להעניק. לא. IOS 1354956. אנו מודים ד ר אנדרו ד וורן (מרכז מקגוויר פרפראים, המגוון הביולוגי, פלורידה המוזיאון להיסטוריה של הטבע, אוניברסיטת פלורידה) רשות להשתמש בתמונות פרפר.
Materials
| 20% sucrose solution | Domino Sugar | Sugar needed to produce the sucrose solution with dH2O | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P5493 | 10X concentration diluted to 1X in dH2O for insect dissections |
| Single depression concave slide | AmScope | BS-C6 | Slide is necessary for feeding stage setup |
| Filter paper | EMD Millipore | NY6004700 (60 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY4104700 (41 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY3004700 (30 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY2004700 (20 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | NY1104700 (11 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TCTP04700 (10 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TETP04700 (8 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | TMTP04700 (5 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Filter paper | EMD Millipore | RTTP04700 (1 µm) | Nylon net filters and isopore filters needed to produce a porous surface for insect feeding |
| Iris microdissecting scissors | Carolina Biological Supply Company | 623555 | Scissors used for dissections |
| Insect pins (#1) | Bioquip Products | 1208B1 | Pins used during dissections and feeding trials |
| Extra-fine point dissecting forceps | Carolina Biological Supply Company | 624684 | Dissecting equipment |
| Leica M205 C Stereoscope | Leica Microsystems | M205 C | Stereoscope used for dissections |
| Inverted confocal microscope | Olympus | IX81 | Fluorescent microscope used to detect magnetic nanoparticles |
| Fisherbrand PTFE Disposable Stir Bar | Fisherscientific | S68067 | Magnet used to detect nanoparticles |
| Kimtech Science Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34155 | Tissues used to secure insects during feeding trials |
| House fly (Musca domestica) pupae | Mantisplace.com | insects for experiments | |
| Blue bottle fly (Calliphora vomitoria) pupae | Mantisplace.com | insects for experiments | |
| Cabbage butterfly (Pieris rapae) larvae | Carolina Biological Supply Company | 144102 | insects for experiments |
| Finnpipette F1 | ThermoFisher Scientific | 4641080N | micropipette for dispensing liquids |
| Finntip 250 pipette tips | ThermoFisher Scientific | 9400250 | micropipette tips |
| Microscope Glass cover slides (=coverslips) (24 x 24 mm) | AmScope | CS-S24-100 | coverslips for viewing the insect's crop on confocal microscope |
References
- Vijaysegaran, S., Walter, G. H., Drew, R. A. I. Mouthpart structure, feeding mechanisms, and natural food sources of adult Bactrocera (Diptera: Tephritidae). Ann Entomol Soc Am. 90, 184-201 (1997).
- Lehnert, M. S., Monaenkova, D., Andrukh, T., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. Hydrophobic-hydrophilic dichotomy of the butterfly proboscis. J R Soc Interface. 10, 1-10 (2013).
- Zhao, J., Wu, J., Yan, S. Erection mechanism of glossal hairs during honeybee feeding. J Theor biol. 386, 62-68 (2015).
- Redak, R. A., Purcell, A. H., Lopes, J. R. S., Blua, M. J., Mizell, R. F., Andersen, P. C. The biology of xylem fluid-feeding insect vectors of Xylella fastidiosa and their relation to disease epidemiology. Ann. Review Entomol. 49, 243-270 (2004).
- Büttiker, W., Krenn, H. W., Putterill, J. F. The proboscis of eye-frequenting and piercing Lepidoptera (Insecta). Zoomorphology. 116, 77-83 (1996).
- Light, J. E., Smith, V. S., Allen, J. M., Durden, L. A., Reed, D. L. Evolutionary history of mammalian sucking lice (Phthiraptera: Anoplura). BMC Evol Biol. 10, (2010).
- Krenn, H. W., Aspock, H. Form, function and evolution of the mouthparts of blood-feeding Arthropoda. Arthropod Struct Dev. 41, 101-118 (2012).
- Lehnert, M. P., Pereira, R. M., Koehler, P. G., Walker, W., Lehnert, M. S. Control of Cimex lectularius using heat combined with dichlorvos resin strips. Med Vet Entomol. 25, 460-464 (2011).
- Zaspel, J. M., Kononenko, V. S., Goldstein, P. Z. Another blood feeder? Experimental feeding of a fruit-piercing moth species on human blood in the Primorye Territory of far eastern Russia (Lepidoptera: Noctuidae: Calpinae). J Insect Behav. 20, 437-451 (2007).
- Barth, F. G. . Insects and flowers: the biology of a partnership. , (1991).
- Foil, L. D., Adams, W. V., McManus, J. M., Issel, C. J. Bloodmeal residues on mouthparts of Tabanus fuscicostatus (Diptera: Tabanidae) and the potential for mechanical transmission of pathogens. J Med Entomol. 24, 613-616 (1987).
- Monaenkova, D., et al. Butterfly proboscis: combining a drinking straw with a nanosponge facilitated diversification of feeding habits. J R Soc Interface. 9, 720-726 (2012).
- Lehnert, M. S., et al. Mouthpart conduit sizes of fluid-feeding insects determine the ability to feed from pores. Proc. R. Soc. B. 284, (2017).
- Grimaldi, D., Engel, M. S. . Evolution of the insects. , (2005).
- Adler, P. H., Foottit, R. G. . Insect biodiversity: science and society. , (2009).
- Tsai, C. C., et al. Nanoporous artificial proboscis for probing minute amount of liquids. Nanoscale. 3, (2011).
- Krenn, H. W. Proboscis sensilla in Vanessa cardui (Nympahlidae, Lepidoptera): Functional morphology and significance of flower-probing. Zoomorphology. 118, 23-30 (1998).
- Plateau, J. A. F. Experimental and theoretical researches on the figures of equilibrium of liquid mass withdrawn from the action of gravity. (Transl). Annual Report of the Board Regents Smithsonian Institution. , 207-285 (1863).
- Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. -. K. Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function. BMC Biol. 5, 6 (2007).
- Westneat, M. W., Socha, J. J., Lee, W. -. K. Advances in biological structure, function and physiology using synchrotron x-ray imaging. Annu Rev Physiol. 70, 119-142 (2008).
- Lee, W. -. K., Socha, J. J. Direct visualization of hemolymph flow in the heart of a grasshopper (Schistocerca americana). BMC Physiology. 9, 2 (2009).
- Lehnert, M. S., Mulvane, C. P., Brother, A. Mouthpart separation does not impede butterfly feeding. Arthropod Struct Dev. 43, 97-102 (2014).
- Lehnert, M. S., Beard, C. E., Gerard, P. D., Kornev, K. G., Adler, P. H. Structure of the lepidopteran proboscis in relation to feeding guild. J Morphol. 277, 167-182 (2016).
- Yan, H., Sung, B., Kim, M. -. H., Kim, C. A novel strategy for functionalizable photoluminescent magnetic nanoparticles. Mater. Res. Express. 1, 045032 (2014).
- Kingsolver, J. G., Daniel, T. L. On the mechanics and energetics of nectar feeding in butterflies. J Theor Biol. 76, 167-179 (1979).
- Krenn, H. W. Feeding mechanisms of adult Lepidoptera: Structure, function, and evolution of the mouthparts. Ann Rev Entomol. 55, 307-327 (2010).
- Tsai, C. -. C., Monaenkova, D., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. Paradox of the drinking-straw model of the butterfly proboscis. J Exp Biol. 217, 2130-2138 (2014).
- Bauder, J. A. S., Handschuh, S., Metscher, B. D., Krenn, H. W. Functional morphology of the feeding apparatus and evolution of proboscis length in metalmark butterflies (Lepidoptera: Riodinidae). Biol J Linn Soc. 110, 291-304 (2013).
