体外sumo 法研究相扑 E3 连接活动
Summary
不像泛素酶, 很少有 E3 相扑酶被发现。这一修改的体外sumo 协议能够识别新的相扑 E3 酶由一个体外重建化验。
Abstract
小泛素样修饰 (相扑) 修饰是一种重要的后平移修饰 (PTM), 它主要通过调节蛋白质-蛋白质相互作用来传导信号转导。与泛素修饰类似, sumo 是由一个有序的酶级联, 包括 E1-activating 酶 (SAE1/SAE2), E2-conjugation 酶 (Ubc9) 和 E3-ligase (即, pia 家族, RanBP2 和 Pc2)。然而, 不同于泛, E3 连接是不必要的反应, 但确实提供了精度和效力的相扑共轭。sumo 修饰的蛋白质可以通过在体内通过沉淀与基底特异抗体和免疫与相扑特异抗体来鉴定。然而, 蛋白质相扑 E3 连接活动的演示需要体外重组的 sumo 分析使用纯化酶, 基质, 和相扑蛋白。由于在体外反应, 通常 SAE1/SAE2 和 Ubc9, 单独是足够的相扑共轭, 提高 sumo 的推定 E3 连接并不总是容易被发现。在这里, 我们描述一个修改过的在体外sumo 协议, 一致地识别相扑的修改使用一个体外重组系统。本文还介绍了一种病毒 SUMO-2/3 E3 连接的催化活性钾 bZIP 的分步协议。纯化的 K-bZIP 的 sumo 活动显示在 p53, 一个众所周知的相扑目标。本议定书不仅可以用来阐明新的相扑 E3 酶, 也可用于揭示其相扑 paralog 的特异性。
Introduction
相扑修饰最初被确定为一种可逆的后平移修饰 (PTM), 它调节蛋白质的稳定性1。除了直接共轭外, 相扑也可以通过相扑交互图案 (西姆斯)2的非共价键作用来附加到蛋白质上。类似于氨-磷酸化的分子, 窝藏 Src 同源 2 (SH2) 或酪氨酸绑定 (客运大楼) 域3,4, 相扑修改提供了一个额外的互动平台, 选择性招聘含 SIM 卡的效应蛋白5,6。除了调控信号转导外, 转录因子和染色质重塑分子的 sumo 调节基因表达7,8。对全基因组 sumo 模式的研究显示, 相扑修饰与阳性9、10或负10、11、12转录有关。规则, 部分原因是 sumo 的 paralogue 特异性。
有三主要的相扑亚型蛋白共轭存在于哺乳动物细胞中;这些包括 SUMO-1, 以及高度同源的 SUMO-2 和 SUMO-3 (称为 SUMO-2/3)13。相扑通常是共轭的赖氨酸 (K) 残留在ψKxD/E 共识主题的目标蛋白。在相扑 E3 酶的 SIM 负责的 paralogue 特异性14。与包含数以百计的 E3 酶的泛通路相比, 只有少数相扑 E3 酶确定了15。相扑 E3 酶是由属性定义的, 包括他们的能力 (i) 绑定 Ubc9, (ii) 通过 SIM 域名绑定相扑, 和 (iii) 加强相扑从 Ubc9 到基板转移。E3 连接不是绝对需要的相扑共轭16, 但提供基板和相扑-paralogue 特异性。因为通常只有一小部分的总基质蛋白是相扑修饰, 检测 SUMOylated 蛋白在体内始终是一个挑战。因此, 需要准确和重现性的分析, 以阐明相扑的精确功能。
体外sumo 测定法, 它评价纯化 Ubc9 对基质蛋白 sumo 的催化作用, 是研究相扑改装17的一种很好的检测方法。然而, 相扑 E3 连接活动在大多数情况下, 不能检测或只能检测与变异相扑连接高相扑 E3 连接活动和低基材的特殊性, 由于存在大量的 Ubc918的标准协议.该方法的总体成功与否主要取决于对纯化 Ubc9 的仔细滴定。这里描述的体外sumo 检测是从标准的 sumo 协议中修改的 (请参见材料表)。在卡波西肉瘤相关的疱疹病毒 (KSHV) 重新激活过程中, 对全球相扑的增加的观察促使我们识别出可能负责 sumo 的 E3 连接的病毒性相扑。在小规模筛选的互动蛋白的病毒相扑 E3 连接 K bZIP, p53 被认为是一个新的基板。在本议定书中, 我们详细地展示了在昆虫细胞的步骤涉及的表达和纯化野生型 K bZIP, 病毒相扑 E3 连接与 SUMO-2/3 特异性。纯化的 K-bZIP 的能力, 以提高 sumo p53, 一个众所周知的相扑基质, 是评估的存在减少量的 E1 和 E2 酶。通过这种改良的 sumo 试验, 研究人员可以可靠地定义相扑 E3 连接对 SUMOylate 小说或已知基底的能力, 这是研究蛋白质 sumo 的主要步骤。此外, 该方法有助于鉴别新的相扑 E3 酶低连接活性, 但高基底特异性。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的体外sumo 协议通常用于确定 Ubc9 基板的 sumo 状态。使用标准协议研究相扑 E3 连接 sumo 功能的主要限制是相扑 E1 活化和 E2 共轭酶 Ubc9 的丰度, 在体外系统中最大限度地发挥相扑共轭作用。考虑到这一挑战, 我们认为, 将相扑 E1 和 E2 酶的量滴定到一个几乎无法检测到它们在 sumo 中活动的水平, 是确定相扑 E3 连接催化活性的唯一途径, 这是利用这种体外sumo 系统。根据这?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了科学和技术部 (多数, 105-2320-010-007-MY3 至 pcc) 的资助, 从国家卫生研究所 (NHRI-EX105-10215BC 到 pcc), 从科学技术部 (最多 105-2314-b-400-019HJK) 和国家卫生研究所 (人权机构 MG-105-SP-10、人权署 MG-106-SP-10 到 HJK)。这项工作也得到了部分与国立阳明大学的手稿出版物, 以 PCC。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或对原稿的补救没有作用。
Materials
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
References
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