In Vitro SUMOylation analyse at studere SUMO E3 Ligase aktivitet
Summary
I modsætning til ubiquitin ligases, er par E3 SUMO ligases blevet identificeret. Denne modificerede in vitro- SUMOylation protokol er købedygtig identificere roman SUMO E3 ligases ved en in vitro- rekonstitution assay.
Abstract
Lille ubiquitin-lignende modifier (SUMO) ændring er en vigtig posttranslationel modifikation (PTM) der medierer signaltransduktion primært gennem modulerende protein-protein interaktioner. Lig ubiquitin modifikation, SUMOylation er instrueret af en sekventiel enzym kaskade herunder E1-aktivering enzym (SAE1/SAE2), E2-konjugation enzym (Ubc9) og E3-ligase (dvs., PIA’ER familie, RanBP2 og Pc2). Forskellige fra ubiquitination, en E3 ligase er dog ikke-væsentlige for reaktionen, men ikke giver præcision og effektivitet for SUMO konjugering. Proteiner ændret af SUMOylation kan identificeres ved i vivo assay via immunoprecipitation med substrat-specifikke antistoffer og immunoblotting med SUMO-specifikke antistoffer. Demonstration af protein SUMO E3 ligase aktivitet kræver dog i vitro rekonstituering af SUMOylation assays ved hjælp af renset enzymer, substrat og SUMO proteiner. Da i in vitro- reaktioner, normalt SAE1/SAE2 og Ubc9, alene er tilstrækkeligt til SUMO konjugering, er forbedring af SUMOylation af en formodet E3 ligase ikke altid let at opdage. Her, beskriver vi en modificeret in vitro- SUMOylation-protokollen, der konsekvent identificerer SUMO ændring ved hjælp af en in vitro- rekonstitueres system. En trinvis protokol til at rense katalytisk aktive K-bZIP, en viral SUMO-2/3 E3 ligase, er også præsenteret. Den renset K-bZIP SUMOylation aktiviteter er vist på p53, en velkendt mål af SUMO. Denne protokol kan ikke kun være ansat for belyse roman SUMO E3 ligases, men også for at afsløre deres SUMO paralog specificitet.
Introduction
SUMO ændring blev oprindeligt identificeret som en reversibel posttranslationel modifikation (PTM), der regulerer protein stabilitet1. Ud over direkte konjugering, kan SUMO også være knyttet til et protein gennem non-kovalente interaktion af SUMO interaktion motiver (SIMs)2. Svarende til binding af tyrosyl-fosforylering af molekyler husly Src homologi 2 (SH2) eller phosphotyrosine bindende (PTB) domæner3,4, SUMO ændring giver en yderligere interaktion platform for selektiv rekruttering af SIM-holdige effektor proteiner5,6. Ud over regulering af signaltransduktion tjene SUMOylation transcriptional faktorer og kromatin remodeling molekyler til at modulere gen expression7,8. Undersøgelser af genome-wide SUMOylation mønstre har afsløret, at SUMO ændring er forbundet med enten positive9,10 eller negative10,11,12 transskription forordning, delvis på grund af paralogue, der kendetegner SUMOylation.
Der er tre store SUMO isoformer for protein de tråddannende øjeblikket i pattedyrceller; Disse omfatter SUMO-1, og yderst homologe SUMO-2 og SUMO-3 (benævnt SUMO-2/3)13. SUMO er normalt konjugeret med lysin (K) restkoncentrationer i ψKxD/E konsensus motiv i target proteinet. SIM i SUMO E3 ligases er ansvarlig for paralogue specificiteten14. I modsætning til ubiquitination veje der indeholder hundredvis af E3 ligases, har der kun været et par SUMO E3 ligases identificeret15. SUMO E3 ligases er defineret ved egenskaber, herunder deres evne til at (i) binde Ubc9, (ii) binder SUMO gruppe via et SIM-domæne og III forbedre SUMO overførsel fra Ubc9 over på bærematerialet. E3 ligase ikke er absolut nødvendige for SUMO konjugation16men giver substrat og SUMO-paralogue specificitet. Siden normalt kun en lille brøkdel af den samlede substrat protein er SUMO-modificeret, er påvisning af SUMOylated proteiner i vivo altid en udfordring. Derfor, nøjagtige og reproducerbare assays er nødvendige for at belyse den præcis funktion af SUMO ændring.
Til i vitro SUMOylation analyse, som evaluerer renset Ubc9 evne til at katalysere SUMOylation af substrat proteiner, er et godt anerkendte assay for at studere SUMO modifikation17. Men SUMO E3 ligase aktivitet i de fleste tilfælde ikke kan registreres eller kan kun påvises med muterede SUMO ligase med høj SUMO E3 ligase aktivitet og lav substrat specificitet ved standardprotokollen på grund af tilstedeværelsen af en rigelig mængde af Ubc918 . Den samlede succes af denne analyse afhænger i høj grad forsigtige titrering af renset Ubc9. Til i vitro SUMOylation analyse beskrevet her er ændret fra et standard SUMOylation protokol (Se Tabel af materialer). Observation af øget global SUMO ændring under Kaposis sarkom-associerede herpesvirus (KSHV) reaktivering foranledigede os til at identificere den virale SUMO E3 ligase, der kan være ansvarlig for op-regulering af SUMOylation. Efter en mindre screening af de interagerende proteiner af viral SUMO E3 ligase K-bZIP, p53 blev identificeret som en roman substrat. I denne protokol viser vi i detaljer i insekt celler trin involveret i den proteinekspression og -oprensning af wild-type K-bZIP, en viral SUMO E3 ligase med SUMO-2/3 specificitet. Den renset K-bZIP evne til at forbedre SUMOylation af p53, en velkendt SUMO substrat, er evalueret i tilstedeværelsen af reducerede mængder af E1 og E2 enzymer. Ved hjælp af denne modificerede SUMOylation assay, kan forskere pålideligt definere evner af SUMO E3 ligase SUMOylate roman eller kendte substrater, som er en primær skridt i studiet af protein SUMOylation. Derudover hjælper denne metode til at identificere roman SUMO E3 ligases med lav ligase aktivitet men høj substrat specificitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro- SUMOylation protokollen beskrevet her bruges rutinemæssigt til at etablere SUMOylation status for identificerede Ubc9 substrater. Den største begrænsning ved hjælp af standard-protokol til at studere funktionen SUMOylation af SUMO E3 ligase er overfloden af aktivering af SUMO E1 og E2 de tråddannende enzymer Ubc9, at Maksimer SUMO konjugation i in vitro- systemer. I betragtning af denne udfordring mener vi titreringen af mængden af SUMO E1 og E2 enzymer til niveauet, at man knap kan regi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra ministeriet for videnskab og teknologi (de fleste, 105-2320-B-010-007-MY3 til PCC), fra National Health Research Institute (NHRI-EX105-10215BC til PCC), fra ministeriet for videnskab og teknologi (mest 105-2314-B-400-019 til HJK) og fra National Health Research Institute (NHRI MG-105-SP-10, NHRI MG-106-SP-10 til HJK). Dette arbejde blev også støttet dels med National Yang-Ming University på manuskriptet publikation til PCC. Finansieringskilderne spillede ingen rolle i undersøgelse design, dataindsamling og analyse, beslutningen om at offentliggøre eller erstatning af manuskriptet.
Materials
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
References
- Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
- Lin, D. Y., et al. Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors. Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).
- Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells. J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).
- Huang, W. Q., et al. Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis. Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).
- Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin. Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).
- Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex. Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).
- Lyst, M. J., Stancheva, I. A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation. Biochem Soc Trans. 35, 1389-1392 (2007).
- Liu, H. W., et al. Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes. Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).
- Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast. Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).
- Chang, P. C., et al. The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus reactivation. BMC Genomics. 14, 824 (2013).
- Neyret-Kahn, H., et al. Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation. Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).
- Tatham, M. H., et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).
- Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson. World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Knipscheer, P., et al. Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination. Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).
- Vethantham, V., Manley, J. L. In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121 (2009).
- Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus. J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).
- Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation. PLoS Pathog. 11 (7), 1005051 (2015).
- Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. RsrII–a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site. Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Gingold, E. B. Bacterial transformation. Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).
