In Vitro SUMOylation Assay te studeren SUMO E3 Ligase activiteit
Summary
In tegenstelling tot ubiquitin ligases, zijn paar E3 SUMO ligases geïdentificeerd. Deze gewijzigde in vitro SUMOylation protocol vermag roman SUMO E3 ligases identificeren door een reconstructie in vitro assay.
Abstract
Kleine ubiquitin-achtige modifier (SUMO) wijziging is een belangrijke posttranslationele wijziging (PTM) die bemiddelt signaaltransductie voornamelijk via het moduleren van eiwit-eiwitinteractie. Gelijkaardig aan wijziging van de ubiquitin, SUMOylation is geregisseerd door een cascade van de sequentiële enzym waaronder E1-activeren enzym (SAE1/SAE2), E2-conjugatie enzym (Ubc9) en E3-ligase (d.w.z., Pia’s familie, RanBP2 en Pc2). Anders dan ubiquitination, een ligase E3 is echter niet-essentiële voor de reactie maar doet precisie en werkzaamheid voorzien in SUMO Woordherkomst en-opbouw. Aangepast door SUMOylation eiwitten kunnen worden geïdentificeerd door in vivo test via immunoprecipitation met substraat-specifieke antilichamen en immunoblotting met SUMO-specifieke antilichamen. De demonstratie van eiwit SUMO E3 ligase activiteit vereist echter in vitro reconstitutie van SUMOylation tests met behulp van gezuiverde enzymen, substraat en SUMO eiwitten. Omdat in de reacties in vitro , meestal SAE1/SAE2 en Ubc9, alleen volstaan voor SUMO conjugatie, is verbetering van SUMOylation door een vermeende ligase E3 niet altijd gemakkelijk te ontdekken. Hier beschrijven we een gemodificeerde in vitro SUMOylation protocol waarmee consequent SUMO wijziging met behulp van een in vitro gereconstitueerd systeem. Een stapsgewijze protocol voor het zuiveren van catalytically actieve K-bZIP, een virale SUMO-2/3 E3 ligase, wordt ook gepresenteerd. De activiteiten van de SUMOylation van de gezuiverde K-bZIP staan op p53, een bekende doelstelling van SUMO. Dit protocol kan niet alleen worden gebruikt voor het ophelderen van de roman SUMO E3 ligases, maar ook voor het openbaren van de specificiteit van hun SUMO paralog.
Introduction
SUMO wijziging werd aanvankelijk geïdentificeerd als een omkeerbare posttranslationele modificatie (PTM) die proteïne stabiliteit1regelt. Naast directe conjugatie, kan SUMO ook worden verbonden aan een proteïne door niet-covalente interactie SUMO interactie motieven (SIMs)2. Vergelijkbaar met de binding van tyrosyl-fosforylering door moleculen herbergen Src homologie 2 (SH2) of phosphotyrosine binding (PTB) domeinen3,4, SUMO wijziging biedt een extra interactie platform voor selectieve aanwerving van SIM-bevattende effector eiwitten5,6. Naast regelgeving van signaaltransductie, SUMOylation van transcriptionele factoren en chromatine remodeling moleculen dienen te moduleren van gen expressie7,8. Studies van genoom-brede SUMOylation patronen is gebleken dat SUMO wijziging geassocieerd met positieve9,10 of negatieve10,11,12 transcriptie wordt verordening, deels wegens de specificiteit van de paralogue van SUMOylation.
Er zijn drie belangrijke SUMO isoforms voor proteïne conjugating van dit moment in de cellen van zoogdieren; het gaat hierbij om SUMO-1, en de zeer homologe SUMO-2 en SUMO-3 (hierna: SUMO-2/3)13. SUMO is meestal geconjugeerd aan het residu lysine (K) binnen het motief van de ψKxD/E consensus in het doel-eiwit. De SIM-kaart in SUMO E3 ligases is verantwoordelijk voor de paralogue specificiteit14. In tegenstelling tot ubiquitination trajecten met honderden E3 ligases, er alleen geweest een paar SUMO E3 ligases geïdentificeerd15. SUMO E3 ligases worden gedefinieerd door eigenschappen met inbegrip van hun vermogen om (i) Ubc9 binden, (ii) binden SUMO deel daarvan via een SIM-domein, en (iii) het verbeteren van SUMO overdracht van Ubc9 op substraat. Ligase E3 is niet absoluut vereist voor SUMO vervoeging16, maar biedt substraat en SUMO-paralogue specificiteit. Sinds meestal slechts een klein deel van de totale substraat proteïne SUMO-bewerkt is, is detectie van SUMOylated eiwitten in vivo altijd een uitdaging. Daarom, nauwkeurige en reproduceerbare testen nodig zijn om te verhelderen van de precieze functie van SUMO modificatie.
De in vitro SUMOylation assay, die resulteert in het vermogen van gezuiverde Ubc9 om SUMOylation van substraat eiwitten katalyseren, is een goed aanvaard assay voor het studeren SUMO wijziging17. Echter, SUMO E3 ligase activiteit in de meeste gevallen kan niet worden gedetecteerd of kan alleen worden gedetecteerd met gemuteerde SUMO ligase met SUMO E3 ligase hoogactieve en lage substraat specificiteit door het standaardprotocol vanwege de aanwezigheid van een overvloedige hoeveelheid Ubc918 . Het algehele succes van deze bepaling is grotendeels afhankelijk van de zorgvuldige titratie van gezuiverde Ubc9. De in vitro SUMOylation assay hier beschreven is aangepast ten opzichte van een standaard SUMOylation protocol (Zie Tabel van materialen). De waarneming van de toegenomen wereldwijde SUMO wijziging tijdens Kaposisarcoom-geassocieerde herpesvirus (KSHV) reactivering gevraagd ons te identificeren van de virale SUMO E3-ligase dat verantwoordelijk voor de up-regulatie van SUMOylation zijn kan. Naar aanleiding van een kleinschalige screening van de interacterende eiwitten van virale SUMO E3 ligase K-bZIP, p53 werd geïdentificeerd als een roman substraat. In dit protocol tonen we in detail in insect cellen de stappen bij de expressie en de zuivering van wild-type K-bZIP, een virale SUMO E3 ligase met SUMO-2/3 specificiteit betrokken. Het vermogen van de gezuiverde K-bZIP ter verbetering van de SUMOylation van p53, een bekende SUMO substraat, wordt in aanwezigheid van verlaagde bedragen van E1 en E2 enzymen geëvalueerd. Deze gewijzigde SUMOylation assay kunnen, onderzoekers betrouwbaar definieert de capaciteiten van SUMO E3 ligase SUMOylate roman of bekende substraten, dat is een eerste stap in de studie van eiwit SUMOylation. Bovendien, deze methode helpt identificeren roman SUMO E3 ligases met lage ligase activiteit maar hoge substraat specificiteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
De in vitro SUMOylation protocol hier beschreven is routinematig gebruikt om de status van de SUMOylation van geïdentificeerde Ubc9 substraten. De belangrijkste beperking met behulp van het standaardprotocol te bestuderen van de SUMOylation functie van SUMO E3 ligase is de overvloed van het activeren van de SUMO E1 en E2 conjugating enzymen Ubc9 die maximaliseren van de SUMO vervoeging in in vitro -systemen. Gezien deze uitdaging, wij zijn van mening dat titratie van het bedrag van SUMO E1 en E2 enzyme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van het ministerie van wetenschap en technologie (meeste, 105-2320-B-010-007-MY3 naar PCC), van de National Health Research Institute (NHRI-EX105-10215BC naar PCC), van het ministerie van wetenschap en technologie (meest 105-2314-B-400-019 naar HJK) en van de National Health Research Institute (NHRI MG-105-SP-10, NHRI MG-106-SP-10 tot HJK). Dit werk werd ook ondersteund deels met de nationale universiteit van de Yang-Ming op PCC publicatie manuscript. De financiers had geen rol in de studie ontwerp, gegevensverzameling en analyse, besloten tot bekendmaking van of reparatie van het manuscript.
Materials
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
References
- Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
- Lin, D. Y., et al. Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors. Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).
- Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells. J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).
- Huang, W. Q., et al. Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis. Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).
- Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin. Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).
- Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex. Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).
- Lyst, M. J., Stancheva, I. A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation. Biochem Soc Trans. 35, 1389-1392 (2007).
- Liu, H. W., et al. Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes. Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).
- Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast. Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).
- Chang, P. C., et al. The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus reactivation. BMC Genomics. 14, 824 (2013).
- Neyret-Kahn, H., et al. Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation. Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).
- Tatham, M. H., et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).
- Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson. World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Knipscheer, P., et al. Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination. Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).
- Vethantham, V., Manley, J. L. In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121 (2009).
- Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus. J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).
- Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation. PLoS Pathog. 11 (7), 1005051 (2015).
- Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. RsrII–a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site. Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Gingold, E. B. Bacterial transformation. Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).
