इन विट्रो SUMOylation परख सूमो E3 Ligase गतिविधि का अध्ययन करने के लिए
Summary
ubiquitin ligases के विपरीत, कुछ E3 सूमो ligases पहचान की गई है । इन विट्रो SUMOylation प्रोटोकॉल में संशोधित एक इन विट्रो पुनर्गठन परख द्वारा उपंयास सूमो E3 ligases की पहचान करने में सक्षम है ।
Abstract
छोटे ubiquitin की तरह संशोधक (सुमो) संशोधन एक महत्वपूर्ण पद अनुवाद संशोधन (PTM) है कि मुख्य रूप से प्रोटीन प्रोटीन बातचीत संग्राहक के माध्यम से संकेत transduction मध्यस्थता है । ubiquitin संशोधन करने के लिए इसी तरह, SUMOylation E1-सक्रिय एंजाइम (SAE1/SAE2), E2-विकार एंजाइम (Ubc9), और E3-ligase (यानी, PIAS परिवार, RanBP2, और Pc2) सहित एक अनुक्रमिक एंजाइम झरना द्वारा निर्देशित है । हालांकि, ubiquitination से अलग है, एक E3 ligase गैर प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक है, लेकिन सटीक और प्रभावकारिता प्रदान करता है सूमो विकार के लिए । SUMOylation द्वारा संशोधित प्रोटीन सब्सट्रेट विशेष एंटीबॉडी और सूमो-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ immunoblotting के साथ immunoprecipitation के माध्यम से vivo परख में द्वारा पहचाना जा सकता है । हालांकि, प्रोटीन सूमो E3 ligase गतिविधि के प्रदर्शन में इन विट्रो SUMOylation परख के पुनर्गठन की आवश्यकता है शुद्ध एंजाइमों, सब्सट्रेट, और सूमो प्रोटीन का उपयोग कर । के बाद से इन विट्रो में प्रतिक्रियाओं, आमतौर पर SAE1/SAE2 और Ubc9, अकेले सूमो विकार के लिए पर्याप्त हैं, SUMOylation के एक ख्यात E3 ligase द्वारा वृद्धि हमेशा पता लगाने के लिए आसान नहीं है । यहां, हम इन विट्रो SUMOylation प्रोटोकॉल में एक संशोधित वर्णन है कि लगातार सूमो संशोधन एक में इन विट्रो प्रणाली का उपयोग कर पहचानता है । उत्प्रेरक सक्रिय K-bZIP, एक वायरल सूमो-2/3 E3 ligase को शुद्ध करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत किया जाता है । bZIP की शुद्धि के SUMOylation कार्यकलाप p53 पर दिखाए जाते हैं, जो सुमो का सुपरिचित लक्ष्य है. इस प्रोटोकॉल elucidating उपंयास सूमो E3 ligases के लिए ही कार्यरत नहीं हो सकता है, लेकिन यह भी उनके सूमो paralog विशिष्टता खुलासा करने के लिए ।
Introduction
सूमो संशोधन शुरू में एक प्रतिवर्ती बाद अनुवाद संशोधन (PTM) है कि प्रोटीन स्थिरता को विनियमित के रूप में पहचाना गया था1। प्रत्यक्ष विकार के अलावा, सूमो भी सूमो इंटरेक्शन रूपांकनों (SIMs) द्वारा गैर आबंध बातचीत के माध्यम से एक प्रोटीन से जुड़ा जा सकता है2। tyrosyl के बंधन के समान-फास्फारिलीकरण Src समरूपता 2 (SH2) या phosphotyrosine बाइंडिंग (PTB) डोमेन3,4, सूमो संशोधन के लिए एक अतिरिक्त संपर्क मंच प्रदान करता है के लिए चयनित सिम युक्त प्रभाव वाले प्रोटीन की भर्ती5,6. संकेत transduction के विनियमन के अलावा, transcriptional कारकों और क्रोमेटिन remodeling अणुओं के SUMOylation जीन अभिव्यक्ति7,8का नियमन करने की सेवा । जीनोम-वाइड SUMOylation पैटर्न के अध्ययनों से पता चला है कि सूमो संशोधन या तो सकारात्मक9,10 या नकारात्मक10,11,12 प्रतिलेखन के साथ जुड़ा हुआ है विनियमन, SUMOylation की paralogue विशिष्टता के कारण भाग में ।
स्तनधारी कोशिकाओं में मौजूद प्रोटीन conjugating के लिए तीन प्रमुख सूमो isoforms हैं; इनमें सूमो-1, और अत्यधिक मुताबिक़ सूमो-2 और सूमो-3 शामिल है (सूमो-2/13के रूप में संदर्भित । सूमो आमतौर पर संयुग्मित है lysine (कश्मीर) ψKxD/ई के भीतर अवशेष लक्ष्य प्रोटीन में आम सहमति आकृति । सूमो E3 ligases में सिम paralogue विशिष्टता14के लिए जिंमेदार है । ubiquitination e3 ligases के सैकड़ों युक्त रास्ते के विपरीत, वहां केवल कुछ सूमो E3 ligases15की पहचान की गई है । सूमो E3 ligases उनके (मैं) बांध Ubc9, (ii) एक सिम डोमेन के माध्यम से बांध सूमो moiety की क्षमता सहित संपत्तियों द्वारा परिभाषित कर रहे हैं, और (iii) सब्सट्रेट पर Ubc9 से सूमो हस्तांतरण को बढ़ाने । E3 ligase बिल्कुल सूमो विकार के लिए आवश्यक नहीं है16, लेकिन सब्सट्रेट और सूमो-paralogue विशिष्टता प्रदान करता है । के बाद से आमतौर पर केवल कुल सब्सट्रेट प्रोटीन का एक छोटा सा अंश सूमो संशोधित है, vivo में SUMOylated प्रोटीन का पता लगाने हमेशा एक चुनौती है. इसलिए, सटीक और प्रतिलिपि परख के लिए सूमो संशोधन के सटीक समारोह स्पष्ट की जरूरत है ।
इन विट्रो SUMOylation परख, जो सब्सट्रेट प्रोटीन के उत्प्रेरित SUMOylation को शुद्ध Ubc9 की क्षमता का मूल्यांकन करता है, एक अच्छी तरह से स्वीकार किए जाते है सूमो संशोधन17के अध्ययन के लिए परख है । हालांकि, ज्यादातर मामलों में सूमो e3 ligase गतिविधि का पता लगाया जा सकता है या केवल उच्च सूमो E3 ligase गतिविधि और कम सब्सट्रेट विशिष्टता के साथ मानक प्रोटोकॉल के एक प्रचुर मात्रा में Ubc9 की उपस्थिति की वजह से की पहचान की गई सूमो ligase के साथ पता लगाया जा सकता18 . इस परख की समग्र सफलता काफी हद तक शुद्ध Ubc9 के सावधान अनुमापन पर निर्भर करता है । इन विट्रो SUMOylation परख यहां वर्णित एक मानक SUMOylation प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया है ( सामग्री की तालिकादेखें) । है Kaposi सार्कोमा के दौरान वृद्धि हुई वैश्विक सूमो संशोधन के प्रेक्षण-एसोसिएटेड gerpevirusnoy (KSHV) पुनर्सक्रियण हमें प्रेरित करने के लिए वायरल सूमो E3 ligase की पहचान है कि अप के लिए जिंमेदार हो सकता है SUMOylation के विनियमन । वायरल सूमो E3 ligase K-bZIP के बातचीत प्रोटीन के एक छोटे पैमाने पर स्क्रीनिंग के बाद, p53 एक उपंयास सब्सट्रेट के रूप में पहचाना गया था । इस प्रोटोकॉल में, हम कीट कोशिकाओं में विस्तार से दिखाने के कदम अभिव्यक्ति और वंय-प्रकार कश्मीर के शुद्धि में शामिल-bZIP, एक वायरल सूमो E3 सूमो के साथ ligase-2/ शुद्ध K-bZIP की क्षमता p53, एक प्रसिद्ध सूमो सब्सट्रेट के SUMOylation को बढ़ाने के लिए, E1 और E2 एंजाइमों की कम मात्रा की उपस्थिति में मूल्यांकन किया जाता है । इस संशोधित SUMOylation परख का उपयोग करना, शोधकर्ताओं ने मज़बूती से सूमो E3 ligase की क्षमताओं को परिभाषित कर सकते है SUMOylate उपंयास या जाना जाता है सब्सट्रेट, जो प्रोटीन SUMOylation के अध्ययन में एक प्राथमिक कदम है । इसके अलावा, इस विधि कम ligase गतिविधि लेकिन उच्च सब्सट्रेट विशिष्टता के साथ उपंयास सूमो E3 ligases की पहचान में मदद करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इन विट्रो SUMOylation प्रोटोकॉल यहां वर्णित नियमित रूप से पहचान Ubc9 सब्सट्रेट की SUMOylation स्थिति स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । प्रमुख मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए सूमो E3 ligase के SUMOylation समारोह का अध?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी मंत्रालय (सर्वाधिक, 105-2320-बी-010-007-MY3 को पीसीसी) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया, राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (NHRI-EX105-10215BC से पीसीसी), विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी मंत्रालय से (सर्वाधिक 105-2314-बी-400-019 HJK करने के लिए) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (NHRI मिलीग्राम-१०५-एसपी-10, NHRI मिलीग्राम-१०६-sp-10 से HJK) । यह काम भी राष्ट्रीय यांग-मिंग विश्वविद्यालय के साथ पांडुलिपि प्रकाशन पर पीसीसी के लिए आंशिक रूप से समर्थन किया गया था । funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि के मरंमत में कोई भूमिका नहीं थी ।
Materials
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
References
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