In Vitro Saggio di SUMOilazione per studiare l'attività E3 ligasi SUMO
Summary
A differenza di ubiquitin-ligasi, sono stati identificati alcuni ligasi E3 SUMO. Questo modificate in vitro sumoilazione protocollo è in grado di identificare il romanzo SUMO E3 ligasi mediante saggio di ricostituzione in vitro .
Abstract
Modifica piccolo ubiquitina-come modificatore (SUMO) è un’importante modificazione post-traduzionale (PTM) che media la trasduzione del segnale principalmente attraverso interazioni proteina-proteina di modulazione. Simile alla modifica di ubiquitina, sumolazione è diretto da una cascata enzimatica sequenziale tra cui enzima E1-attivazione (SAE1/SAE2), enzima di coniugazione E2 (Ubc9) ed E3-ligasi (cioè, pia famiglia, RanBP2 e Pc2). Tuttavia, a differenza di ubiquitinazione, una ligasi E3 non è essenziale per la reazione, ma non fornire la precisione e l’efficacia per la coniugazione di SUMO. Proteine modificate da SUMOylation possono essere identificati dall’analisi in vivo tramite immunoprecipitazione con anticorpi specifici per substrato e immunoblotting con anticorpi specifici per SUMO. Tuttavia, la dimostrazione dell’attività della proteina SUMO E3 ligasi richiede la ricostituzione in vitro di SUMOilazione saggi utilizzando enzimi purificati, substrato e proteine SUMO. Poiché nelle reazioni in vitro , solitamente SAE1/SAE2 e Ubc9, da soli sono sufficienti per la coniugazione di SUMO, valorizzazione di sumoilazione di una putativa ligasi E3 non è sempre facile da rilevare. Qui, descriviamo una modificate in vitro sumoilazione protocollo che identifica costantemente modificati di SUMO utilizzano un sistema in vitro ricostituito. Un protocollo di passo-passo per purificare cataliticamente attiva K-bZIP, una virale SUMO-2/3 E3 ligasi, inoltre è presentato. Le attività di SUMOilazione della K-bZIP purificato sono esposte su p53, una destinazione ben nota di SUMO. Questo protocollo può essere impiegato non solo per il delucidamento romanzo SUMO E3 ligasi, ma anche per rivelare la loro specificità di paralog SUMO.
Introduction
Modifica di SUMO è stato inizialmente identificato come una modificazione post-traduzionale reversibile (PTM) che regola la stabilità della proteina1. Oltre a coniugazione diretta, SUMO può anche essere collegato ad una proteina attraverso l’interazione non-covalente di SUMO interazione motivi (SIMs)2. Simile all’associazione di tyrosyl-fosforilazione di molecole che harboring Src homology 2 (SH2) o phosphotyrosine binding (PTB) domini3,4, modifica di SUMO fornisce una piattaforma di interazione aggiuntiva per selettiva assunzione di5,di proteine effettrici SIM contenenti6. Oltre alla regolazione della trasduzione del segnale, sumoilazione di fattori trascrizionali e molecole di rimodellamento della cromatina servono a modulare l’espressione genica7,8. Gli studi di pattern di SUMOilazione del genoma hanno rivelato che modifica di SUMO è associato con positivo9,10 o negativo10,11,12 trascrizione regolamento, in parte a causa della specificità paralogo di SUMOilazione.
Ci sono tre isoforme principali di SUMO per proteina coniugando presente in cellule di mammiferi; Questi includono SUMO-1 e il SUMO-2 altamente omologa e SUMO-3 (denominato SUMO-2/3)13. SUMO è solitamente coniugata con il residuo di lisina (K) all’interno del motivo di ψKxD/E consenso nella proteina bersaglio. SIM nel SUMO E3 ligasi è responsabile della specificità paralogo14. In contrasto con le vie di ubiquitinazione contenente centinaia di E3 ligasi, ci sono stati solo pochi SUMO E3 ligasi identificati15. Ligasi E3 SUMO sono definiti dalla proprietà, inclusa la capacità di (i) associare Ubc9, (ii) associare frazione SUMO tramite un dominio SIM e (iii) migliorare il trasferimento di SUMO da Ubc9 sul substrato. Ligasi E3 non è assolutamente necessaria per SUMO coniugazione16, ma fornisce il substrato e SUMO-paralogo specificità. Dal solito solo una piccola frazione della proteina totale substrato è SUMO-modificato, la rilevazione di proteine SUMOilate in vivo è sempre una sfida. Pertanto, sono necessari dosaggi accurati e riproducibili per delucidare la precisa funzione di modifica di SUMO.
Lo in vitro test sumoilazione, che valuta la capacità di catalizzare sumoilazione delle proteine substrato Ubc9 purificato, è un saggio ben accettato per lo studio di SUMO modifica17. Tuttavia, attività di ligasi E3 SUMO nella maggior parte dei casi non può essere rilevato o possono essere rilevati solo con mutata ligasi SUMO con alta attività SUMO E3 ligasi e specificità di substrato basso dal protocollo standard a causa della presenza di una quantità abbondante di Ubc918 . Il successo globale di questo dosaggio dipende in gran parte la titolazione attenta di Ubc9 purificata. Il saggio in vitro sumoilazione descritto qui è stato modificato da un sumoilazione standard protocollo (Vedi Tabella materiali). L’osservazione di modificazione di SUMO globale aumentata durante la riattivazione del herpesvirus associato al sarcoma di Kaposi (KSHV) spinti ad identificare la ligasi E3 SUMO virale che può essere responsabile per l’up-regolazione di SUMOilazione. A seguito di uno screening su piccola scala delle proteine d’interazione di virale SUMO E3 ligasi K-bZIP, p53 è stato identificato come un substrato romanzo. In questo protocollo, vi mostriamo nel dettaglio nelle cellule di insetto i passaggi coinvolti nell’espressione e purificazione di selvaggio-tipo K-bZIP, una SUMO E3 ligasi virale con specificità di SUMO-2/3. La capacità del K-bZIP purificata per migliorare la sumoilazione di p53, un ben noto substrato SUMO, è valutata in presenza di ridotte quantità di enzimi E1 ed E2. Utilizzando questa analisi modificata di SUMOilazione, i ricercatori possono attendibilmente definire le capacità di SUMO E3 ligasi SUMOylate romanzo o substrati noti, che è un passo principale nello studio della proteina sumoilazione. Inoltre, questo metodo consente di identificare il romanzo SUMO E3 ligasi con basso ligasi attività ma la specificità di substrato alta.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo in vitro sumoilazione protocollo descritto qui è usata ordinariamente per stabilire lo stato di sumoilazione di identificati Ubc9 substrati. La limitazione principale utilizzando il protocollo standard per studiare la funzione di sumoilazione di SUMO E3 ligasi è l’abbondanza di SUMO E1 attivando ed enzimi di coniugazione E2 Ubc9 che massimizzano la coniugazione di SUMO in sistemi in vitro . Considerando questa sfida, noi crediamo che titolazione della quantità di enzimi SUMO E1 ed E2 al livello ch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata sostenuta da sovvenzioni dal Ministero della scienza e tecnologia (la maggior parte, 105-2320-B-010-007-MY3 a PCC), dall’Istituto di ricerca di salute nazionale (vi-EX105-10215BC a PCC), dal Ministero della scienza e tecnologia (più 105-2314-B-400-019 di HJK) e dell’Istituto di ricerca di salute nazionale (vi MG-105-SP-10, vi MG-106-SP-10 di HJK). Questo lavoro è stato supportato anche parzialmente con National Yang-Ming University sulla pubblicazione del manoscritto di PCC. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dati e analisi, decisione di pubblicare o riparazione del manoscritto.
Materials
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
References
- Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
- Lin, D. Y., et al. Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors. Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).
- Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells. J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).
- Huang, W. Q., et al. Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis. Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).
- Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin. Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).
- Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex. Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).
- Lyst, M. J., Stancheva, I. A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation. Biochem Soc Trans. 35, 1389-1392 (2007).
- Liu, H. W., et al. Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes. Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).
- Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast. Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).
- Chang, P. C., et al. The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus reactivation. BMC Genomics. 14, 824 (2013).
- Neyret-Kahn, H., et al. Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation. Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).
- Tatham, M. H., et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).
- Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson. World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Knipscheer, P., et al. Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination. Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).
- Vethantham, V., Manley, J. L. In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121 (2009).
- Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus. J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).
- Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation. PLoS Pathog. 11 (7), 1005051 (2015).
- Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. RsrII–a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site. Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Gingold, E. B. Bacterial transformation. Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).
