Isolering och odling av neurala föräldraparets följt av kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lysin 79 Dimethylation varumärke
Summary
Vi presenterar en effektiv och reproducerbar metod för att isolera och kultur neurala stamceller från embryonala och postnatal hjärnvävnad för kromatin immunoprecipitation (ChIP) av Histon 3 lysin 79 dimethylation (H3K79me2) – en Histon mark ligger inom den klotformig domän Histon 3.
Abstract
Hjärnans utveckling är en komplex process som styrs på ett temporo-spatial sätt av lutningar av morphogens och olika transkriptionell program. Dessutom har epigenetiska kromatin ändringar, som Histon metylering, en viktig roll för att etablera och upprätthålla viss cell öden inom denna process. Den stora majoriteten av Histon metylering sker på flexibla Histon svansen, som är tillgänglig för Histon modifierare, suddgummin och Histon läsaren proteiner. Däremot H3K79 metylering ligger i domänen klotformiga av Histon 3 och är inblandad i olika utvecklings funktioner. H3K79 metylering är evolutionärt bevarade och finns i ett brett spektrum av arter från Homo sapiens till Saccharomyces cerevisiae. Förändringen inträffar i olika cellpopulationer inom organismer, inklusive neurala progenitorceller. Platsen för H3K79 metylering i domänen klotformiga av Histon 3 gör det svårt att bedöma. Här presenterar vi metoder att isolera och kultur kortikala progenitor cells (CPC) från embryonala kortikala hjärnvävnad (E11.5-E14.5) eller cerebellär granulat neuron stamfäder (CGNPs) från postnatal vävnad (P5-P7), och att effektivt immunoprecipitate H3K79me2 för kvantitativ PCR (qPCR) och genome-wide sekvensering.
Introduction
De sensoriska, motoriska och kognitiva funktionerna i hjärnan är mycket komplexa och känsliga för fysiska och miljömässiga förändringar. Hjärnan består av tre allmänna delar av hind-, mid-, och framhjärnan, som förbinds djupt. Inom framhjärnan, kan telencephalon delas in i en dorsal telencephalon (DT) och en ventral telencephalon (VT). DT av möss består av sex kortikala skikt som bildas mellan E11.5 och E18.5 i en ”inside-out” sätt1. VT innehåller de ganglieblockerande eminenser i utveckling, som senare bildar den basala ganglier2,3. Flera celltyper kan klassificeras i däggdjur centrala nervsystemet såsom nervceller, astrocyter och oligodendrocyter4, som utvecklas i en temporo-spatial sätt5. Först ger de neurala stamceller (NPC) upphov till olika typer av nervceller, interneuroner i VT och projektion nervceller i DT, och senare vidare till gliaceller (t.ex., astrocyter6). Under kortikala utveckling, det mest ytliga lagret (lager jag), som innehåller Cajal-Retzius celler, bildas först. Sedan, mellan E12.5 och E14.5, NPCs skapa djupare neuronala lager (VI, V) medan mellan 14,5 och 16,5, stamfäder ge upphov till övre lagret (IV-II) nervceller7,8. Neuronala identitet anges genom olika morphogen-inducerad temporo-spatial transkriptionell program och dessutom epigenetiska program2.
Lillhjärnan, som är inblandade i finmotorik samordning, ligger i hindbrain och utvecklas mellan E10 och ungefär P20 i möss9. Den innehåller cerebellar cortex och cerebellär kärnor10. Adult cerebellar cortex består av tre lager, det yttersta molekylära lagret, det Purkinje cell-lagret och den innersta korniga lagret som innehåller granulat nervceller10. Cerebellär granule celler är de minsta nervcellerna och utgör cirka 80 procent av alla neuroner i ryggradsdjur hjärnan11. De utvecklas från prekursorer ligger i zonen för externa germinal och migrera genom Purkinje celler lagret till sin destination12. Som i telencephalon, utvecklingen av lillhjärnan regleras av flera viktiga morphogens, definieras som har särskilda och utrymme-tidsberoende funktioner och initiera transkriptionell program10.
Utvecklingen av kortikala och cerebellär lager styrs av transkriptionell uttryck av specifika morphogens och därmed av kromatin staten av DNA. I en förenklad vy, kan kromatin stater delas in i euchromatin som transcriptionally aktiv och Heterokromatin som transcriptionally tyst regioner. Nukleosomens som den grundläggande enheten av kromatin innehåller två kopior av varje core Histon H2A, H2B, H3 och H4, omgiven av 147 baspar i DNA13. Histoner modifieras högt post-translationally av metylering, acetylering, fosforylering, ubikvitinering, sumoylation, ADP-ribosylering, deaminering och prolin isomerization14,15. Histon lysin metylering anses vara den mest stabila Histon modifiering som styr transkription, replikation, rekombination16, DNA-skada svar17och genomisk prägling18. Lysines kan vara mono-, di- eller tri-metylerat19 och visas inte bara på tillgängliga Histon svansar, utan också inom domänen klotformiga av histoner20. Särskilda methylations vid H3K4 och H3K36 är främst förknippas med euchromatin, särskilda methylations på H3K9, H3K27 eller H4K20 finns huvudsakligen i heterochromatic regioner, även om alla rester ligger inom Histon svans14, 19,21. H3K79 metylering ligger inom domänen Histon klotformig och har associerats med transkriptionell aktivitet, men också med transcriptionally inert genomisk regioner22. Ändringen är evolutionärt bevarade eftersom det har observerats i jäst, kalv bräss, kyckling och mänskliga23. H3K79 mono, di och trimethylation (H3K79me1, me2, me3) är katalyseras av Histon metyltransferaser DOT1L24,25 och den nukleära ange domän-innehållande Protein 2 (Nsd2)26. DOT1L är inblandad i spridning, DNA-reparation och cellular reprograming27. Förlust av Dot1l i möss leder till en prenatal död runt de utvecklingsstadier E10.528,29. Under hjärtat utveckling och myocardiocyte differentiering är DOT1L viktigt för gen uttryck förordning30. I det centrala nervsystemet, DOT1L funktion kan vara inblandade i neuralrörsdefekter utveckling31, är involverade i undertrycka Tbr1-uttryck under framhjärnan utveckling32, och kanske fungerar i regleringen av ER-stress svar gener33. Den innehållsberoende aktivera eller förtränga åtgärder av H3K79me, särskilt med i vivo situationer som utvecklingen av det centrala nervsystemet, är hittills bara delvis förstod32. Eftersom H3K79 metylering är beläget i domänen klotformiga av Histon 3, är det koalisera mindre tillgängliga jämfört med ändringar på flexibla Histon svansar23. För att förstå funktionen av H3K79 metylering, behövs tillförlitliga och reproducerbara analysmetoder för att bestämma dess läge och genomisk miljö. I detta metoder papper presentera vi isoleringsmetoder olika neurala stamfäder (CPC för cortex) och CGNPs för lillhjärnan, effektiv DOT1L hämmare behandling och en ChIP metod att analysera H3K79 metylering via qPCR eller sekvensering vid annan tidpunkt punkter under kortikala och cerebellär utveckling. För en översikt av protokollet och dess möjligheter, se figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns två stora sätt att utföra kromatin immunoprecipitation för att upptäcka genomisk beläggningen i Histon modifieringar, transkriptionsfaktorer, Histon kodläsare, författare eller suddgummin. En är infödda ChIP metod använder nuclease rötas, infödda kromatin för immunoprecipitation, och den andra är den presenterade metoden använder PFA-fast, klippt kromatin, där nucleosomes och andra DNA-anslutna proteiner kovalent bundna till DNA 39. infödda ChIP med dess höga antikropp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Henriette Bertemes för att hjälpa till att upprätta protokollet CGN odling inom labbet. Denna metod papper stöddes av de DFG-finansierade CRC992 medicinsk epigenetik av finansiering till TV. Författarna erkänner stöd av Freiburg Galaxy Team: Pavankumar Videm, Björn Grüning och Prof. Rolf Backofen, bioinformatik, universitetar av Freiburg, Tyskland finansieras av Collaborative Research Centre 992 medicinsk epigenetik (DFG grant SFB 992/1 2012) och tyska förbundsministeriet för utbildning och forskning (BMBF grant 031 A538A RBC (de. NBI)).
Materials
| Anti-GAPDH | Abcam | ab8245 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:5000 |
| Anti-H3 | Abcam | ab1791 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Anti-H3K79me2 | Diagenode | pAb-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP antibody |
| Anti-H3K79me2 | Abcam | ab-051-050 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:1000 |
| Anti-rabbit-IgG | Diagenode | C15410206 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: ChIP Ctrl antibody |
| Anti-Tubulin alpha | Abcam | ab108629 | Category: Antibody Abbreviation/Comment: Immunoblot dilution 1:3000 |
| Apo-Transferrin (1 mg/ml) | Sigma-Aldrich | T1147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| B27 Supplement (50x) | Life Technologies | 17504044 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Bioanalyzer | Agilent technologies | G2940CA | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For analysis of sheared chromatin |
| Bioruptor NextGen | Diagenode | B01020001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Ultrasonicator |
| Boric acid pH 8.4 | Sigma Aldrich | B6768 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| CFX Connect RT PCR Detection System | Bio-Rad | 1855201 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Detection system for qPCR |
| DMEM-F12 | Life Technologies | 11320-033 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| Dynabeads Protein A | Invitrogen | 10001D | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Magnetic beads, for ChIP |
| EPZ-5676 | Selleckchem | S7062 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Ethylenediamine tetraacetic acid | SERVA | 39760.01 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: EDTA |
| Fetal Bovine Serum 10% (v/v) | Gibco | 10082147 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation and CGM |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Glutathione (1.25 mg/ml) | Sigma-Aldrich | G4251 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Glycine | Carl Roth | 3187 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For cell fixation |
| GoTaq mastermix | Promega | A6002 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: DNA polymerase master mix for qPCR |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-100 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: HBSS |
| L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030081 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Lithium chloride | Sigma-Aldrich | L4408 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: LiCl |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGM |
| NanoDrop 3300 | Thermo Fisher | 3300 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Fluorospectrometer for DNA quantification |
| NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | NEB | E7645S | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Kit for Library preparation |
| NEBNext Multiplex Oligos for Illumina | NEB | E7335 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Oligos for Library preparation |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103049 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| NP-40 Alternative | Calbiochem | 492016 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 335 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: PFA, for cell fixation |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin 1% (v/v) | Life Technologies | 15640055 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PSN, for CCM and CGM |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010023 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: PBS, for CPC isolation |
| PicoGreen Kit | Thermo Fisher | P11496 | Category: ChIP Analysis Abbreviation/Comment: Visualizing dye for DNA quantification |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma Aldrich | P3655 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC culturing |
| Potassium chloride | Thermo Fisher | AM9640G | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: KCl, for CGM |
| Protease inhibitor | Roche | 4693159001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115879001 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Qiagen MinElute | Qiagen | 28004 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: Kit for DNA purification |
| RNAse | Sigma-Aldrich | R6513 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| SGC0946 | Selleckchem | S7079 | Category: DOT1L inhibition Abbreviation/Comment: For DOT1L inhibition in cell culture |
| Sodium bicarbonate | Carl Roth | 8551.1 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: for Elution buffer |
| Sodium chloride | Carl Roth | 9265 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: NaCl, for ChIP buffer |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP |
| Sodium dodecylsulfate | Carl Roth | 183 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: SDS, for ChIP |
| Sonic hedgehock (SHH) | Sigma-Aldrich | SRP6004 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CGNP isolation |
| Superoxide dismutase (1mg/ml) | Sigma-Aldrich | S7571 | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CCM |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Carl Roth | 9090 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: TRIS, for ChIP buffer |
| Triton X-100 | Carl Roth | X100 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For ChIP buffer |
| Trypsin-EDTA 0,05% (w/v) | Sigma Aldrich | 59417C | Category: Cell culture Abbreviation/Comment: For CPC isolation |
| Tween20 | Carl Roth | 28320 | Category: ChIP Abbreviation/Comment: For bead preparation |
| Other Lab devices: Neubauer counting chamber, Incubator, Rotator, Shaker, Disection set, Water bath | |||
| CCM: Cortical cell medium | |||
| CGM: CGNP cell culture medium | |||
References
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
- Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science. 290, 1113-1120 (2000).
- Götz, M., Sommer, L. Cortical development: the art of generating cell diversity. Dev. Camb. Engl. 132, 3327 (2005).
- Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. Epigenetic control of neural precursor cell fate during development. Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).
- Davis, A. A., Temple, S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature. 372, 263-266 (1994).
- Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis. Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).
- McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex. Science. 254, 282-285 (1991).
- Desai, A. R., McConnell, S. K. Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development. Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).
- Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. Cerebellum: history. 신경과학. 162, 549-559 (2009).
- Marzban, H., et al. Cellular commitment in the developing cerebellum. Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).
- Azevedo, F. A. C., et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).
- Machold, R., Fishell, G. Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors. Neuron. 48, 17-24 (2005).
- Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
- Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).
- Sanders, S. L., et al. Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage. Cell. 119, 603-614 (2004).
- Martin, C., Zhang, Y. The diverse functions of histone lysine methylation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).
- Greer, E. L., Shi, Y. Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance. Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).
- Ng, H. H., et al. Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association. Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).
- Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest. FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).
- Roidl, D., Hacker, C. Histone methylation during neural development. Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).
- Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure. Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).
- van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core. Cell. 109, 745-756 (2002).
- Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
- Woo Park, J., et al. RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20. Sci. Rep. 5, 12485 (2015).
- Vlaming, H., van Leeuwen, F. The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L. Chromosoma. , (2016).
- Jones, B., et al. The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure. PLoS Genet. 4, e1000190 (2008).
- Feng, Y., et al. Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase. Blood. 116, 4483-4491 (2010).
- Cattaneo, P., et al. DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation. Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).
- Zhang, Q., et al. Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects. Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).
- Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).
- Roidl, D., et al. DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro. Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).
- Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).
- Zhang, Y., et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9, R137 (2008).
- Ramírez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).
- Roidl, D. . Histone modifications during cerebral cortex development. , (2015).
- Turner, B. ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material. Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , (2001).
- Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells. J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).
