ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング
Summary
本稿では、ルシフェラーゼ活性の測定に基づく蛋白質蛋白質の相互作用を決定するための簡単かつ迅速な実験手順について説明します。
Abstract
蛋白質蛋白質の相互作用が最も細胞プロセスのシグナル伝達を中継するための基本的なメカニズムしたがって、新規タンパク質間相互作用のペアとタンパク質の相互作用ダイナミクスを監視の同定植物が環境要因および/または発達の信号に応答する方法を明らかにするため特に重要です。アプローチの茄多は、生体外でまたは生体内で蛋白質蛋白質の相互作用を調べるために開発されています。中でも、イメージング (LCI) 最近設立されたルシフェラーゼ補完アッセイは、体内のタンパク質-タンパク質相互作用を示すため最も簡単で最速の方法です。この分析では、蛋白質または蛋白質 B は、ルシフェラーゼのアミノ末端あるいはカルボキシ末端の半分と融合それぞれ。タンパク質 A とタンパク質 B やり取り、ルシフェラーゼの 2 つの半分が機能とアクティブなルシフェラーゼ酵素を形成する再構成されるでしょう。ルシフェラーゼ活性はルミノまたは CCD カメラで記録できます。LCI 分析他のアプローチと比較して、タンパク質-タンパク質相互作用定性的と定量的の両方を示しています。アグロバクテリウムベンサミアーナ タバコ葉の浸潤は、一時的な蛋白質の表現のため広く使われているシステムです。ライオンズ クラブ国際協会と一過性発現の組み合わせ、これらのアプローチは COP1 と SPA1 の間の物理的な相互作用にジャスモン酸治療後徐々 に短縮されたことを示します。
Introduction
その環境と成長を調整するために、植物は感覚、変換、およびシグナリングのキューに対応するエレガントなシグナル伝達経路を進化してきました。リレー競技で走者のような蛋白質、植物シグナル伝達に必要な選手です。タンパク質間相互作用 (PPI) が携帯電話通信のための主要な役割を果たしていること広く認識されています。蛋白質のリン酸化、アセチル化、劣化がすべてターゲット蛋白質とその変更の酵素間の物理的な相互作用に依存しています。たとえば、ジャスモン酸 ZIM ドメイン蛋白質 (JAZ) ファミリーのタンパク質は転写因子 MYC2 との対話、その転写活性1,2を抑制します。PPI の重要性を与えられた植物の interactomes がされている大規模なタンパク質検討最近3,4,5です。さらにこれらインタラクトームの結果では、多様な細胞機能を調整する複雑な規制のネットワークを明らかにします。
PPI を監視するためいくつかの確立された方法があります。イースト 2 ハイブリッド (Y2H) 試金は、PPI 検出のため最も広く使用されている方法です。Y2H は、蛋白質の相互作用を調べる簡単なテストに適して行うには、簡単です。Y2H も広く、特定興味の蛋白質のための未知の相互作用パートナーをスクリーニングに使用されます。ただし、Y2H が酵母で実施して完全ので植物の本当のシナリオ細胞し、高い偽陽性率をもたらす反映できません。別の似たような戦略は、プルダウン試金です。一般に、2 つのタンパク質が表明したエシェリヒア属大腸菌のセルから浄化し混合し、蛋白質の相互作用を検出するため固定化します。この方法は時間がかかるが、それを取得できません体内の相互作用の結果か。生体内での相互作用目的のため co-免疫沈降 (co IP) は、最も人気のある試金、高品質 immunoprecipitate 興味の蛋白質に抗体を必要とし、間接 PPIs の可能性を除外することはできません。また、co IP で複雑な実験手順、結果通常の専門性と異なります。
記者による再構成の試金は大きく体内PPI の検出を進めます。蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET)6、二分子の蛍光補完 (BiFC)7、イメージング (LCI) 試金8ホタル ルシフェラーゼ補完などの方法。これら 3 つのアプローチが co IP より生体内で直接反映するように PPI、フレット、BiFC 蛍光信号を検出する特定の顕微鏡を必要し、簡単に相互作用強度を定量化することはできません。対照的に、ライオンズ クラブ国際協会はその基質ルシフェリンと反応後光るホタルのルシフェラーゼの活用します。もっと重大に、ルシフェラーゼ活性値から PPI の強さを決定できます。したがって、ライオンズ クラブ国際協会だけではなく 2 つのタンパク質やないとの対話が治療の相互作用ダイナミクスに関する情報も提供するかどうかを示します。10,,の相互作用ダイナミクス (表面プラズモン共鳴または熱安定性変化に基づく)9を監視するためのいくつかの確立された方法がありますがこれらのアプローチは、繊細な楽器や特殊にラベリングを必要があります。対照的に、ライオンズ クラブ国際協会は、検出を行いやすくなっています。
ライオンズ クラブ国際協会のための原則 (N = リュックまたは C = リュックをそれぞれ命名) ルシフェラーゼのアミノ末端とカルボキシル末端の半分は、タンパク質 A と B、およびタンパク質が植物細胞に表現された同時にこれら 2 つの融合と融合しました。タンパク質 A とタンパク質 B やり取り場合、は、アクティブなルシフェラーゼ酵素をルシフェラーゼの 2 つの半分が再構成されるでしょう。ルミノまたは CCD カメラでルシフェラーゼ活性を検出できます。ライオンズ クラブ国際協会; の安定した形質転換体を取得する必要はありません。一過性発現は高品質の相互作用の結果を取得するのに十分です。
リング型 E3 ユビキチン リガーゼ構成 photomorphogenic 1 (COP1) はトランスクリプション要因の無数を操作し、26 s プロテアソーム11を通して彼らの劣化を促進します。これらの COP1 をターゲットとした転写因子のいくつかは、光形態形成過程の正の監督は。暗闇の中、COP1 フィトクロム COP1 E3 活動8を高める A-105 1 (SPA1) の抑制と対話します。光の知覚後、視細胞は COP1 活性を阻害し、安定 COP1 基板12,13,14COP1 SPA1 相互作用を反故します。この例では、PPI を勉強し、PPI ダイナミクスの決定の生物学的意義を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明されているプロトコルはシンプルで留学生体内でタンパク質間相互作用、再現性と外因性治療中タンパク質の相互作用ダイナミクスを検出するために特に適して。(名) ベンサミアーナ浸透この試金の重要なステップであります。浸潤の成功を確保するため、植物は非常に健康でなければなりません。もう一つの重要な要因は、浸透後ルシフェラーゼ活性をチェックす?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、江蘇自然科学財団 (BK20140919)、清 Lan プロジェクト、中国の国家自然科学基金 (31470375) 優先度学術プログラム開発の江蘇高等教育機関によって支えられました。
Materials
| Transformation solution | |||
| 10 mM Morpholineethanesulfonic acid | VETEC | V900336 | |
| 27.8 mM Glucose | VETEC | V900392 | |
| 10 mM MgCl2×6H2O | VETEC | V900020 | |
| 150 μM Acetosyringone | ALDRICH | D134406 | |
| pH 5.7 | |||
| Luciferin working buffer | |||
| 5 mM Luciferin potassium salt | GOLD BIOTECHNOLOGY | LUCK-100 | |
| 0.025% Triton X-100 | VETEC | V900502 | |
| H2O to 10 ml |
References
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