Um romance imagens Live In Vitro e fagocitose mediada por ensaio de Astrocyte usando pH sinaptossomas conjugada com indicador
Summary
Este protocolo apresenta um em vitro de imagem live fagocitose ensaio para medir a capacidade fagocitária dos astrócitos. Microglia e astrócitos rat purificados são usados juntamente com sinaptossomas conjugada com indicador de pH. Esse método pode detectar a cinética de absorção e degradação em tempo real e fornece uma plataforma de triagem adequada para identificar fatores modulando a fagocitose de astrocyte.
Abstract
Astrócitos são o tipo de grandes células no cérebro e contatar diretamente as sinapses e vasos sanguíneos. Embora microglial células foram consideradas as principais células do sistema imunológico e somente os fagócitos no cérebro, estudos recentes têm mostrado que astrócitos também participam de vários processos fagocíticas, tais como eliminação de sinapse desenvolvimento e apuramento das placas de amiloide beta na doença de Alzheimer (AD). Apesar destas constatações, a eficiência de incorporações de astrocyte e a degradação de suas metas é claros comparado com o de micróglia. Esta falta de informação é principalmente devido à falta de um sistema de ensaio em que a cinética de astrocyte e microglia-mediada por fagocitose são facilmente comparáveis. Para atingir este objetivo, temos desenvolvido um longo prazo de imagem ao vivo em vitro fagocitose do ensaio para avaliar a capacidade fagocitária de purificado astrócitos e microglia. Neste ensaio, detecção em tempo real de absorção e degradação é possível usando sinaptossomas conjugada com indicador pH, que emitem fluorescência vermelha brilhante em organelas ácidas, tais como lisossomos. Nosso romance ensaio fornece detecção simples e eficaz de fagocitose através de imagem ao vivo. Além disso, este ensaio de fagocitose em vitro pode ser usado como uma plataforma de triagem para identificar os produtos químicos e compostos que podem melhorar ou inibir a capacidade fagocitária dos astrócitos. Como o mau funcionamento de poda sináptica e acúmulo de proteínas patogênicas foram mostrados para causar distúrbios mentais ou doenças neurodegenerativas, produtos químicos e compostos que modulam a capacidade fagocitária das células gliais devem ser útil no tratamento de várias doenças neurológicas.
Introduction
Células gliais, que se referem às células não-excitáveis no cérebro, são o tipo de células importantes no sistema nervoso central (SNC). Anteriormente, as células gliais foram consideradas como meras células comprovativos que principalmente desempenham um papel passivo na manutenção da sobrevivência neuronal e basais Propriedades sinápticas. No entanto, surgir provas revelou que as células gliais desempenham um papel mais ativo em vários aspectos da neurobiologia, tais como a manutenção da homeostase do cérebro, mediando a sinapse formação1,2,3 e sinapse eliminação de4,5e modulando plasticidade sináptica6,7. Células gliais no SNC incluem astrócitos, oligodendrócitos e micróglia. Entre essas células, astrócitos e microglia têm sido mostrados para desempenhar funções fagocíticas por incorporação de sinapses4,5, de células apoptóticas8, detritos neural9e proteínas patogênicas, tais como beta amyloid placas de10,11. No cérebro em desenvolvimento, astrócitos eliminam sinapses em dorsal geniculado (dLGN) através de de fagocitose dependente MERTK – e MEGF10-4. Da mesma forma, microglia também eliminar sinapses C1q-revestido durante estágios do desenvolvimento até a cascata de complemento clássico5. Curiosamente, tem sido sugerido que defeitos na poda de sinapse podem ser um dos iniciadores de vários distúrbios neurológicos. Por exemplo, ficou demonstrado que mutações no componente do complemento 4 (C4), que aumenta a poda mediada por complemento sinapse por microglia, estão fortemente associadas com a prevalência da esquizofrenia em seres humanos12. Um estudo recente também mostrou que o caminho de complemento clássica é hiperactivos na fase de iniciação da AD e induz a perda precoce da sinapse nesta doença13.
Comparado com fagocitose mediada por microglia, se fagocitose mediada por astrocyte contribui para a iniciação e a progressão de várias doenças neurológicas é menos clara. No entanto, um estudo recente sugere que fatores que alteram a taxa de poda normal sinapse por astrócitos podem perturbar a homeostase do cérebro e contribuir para AD susceptibilidade e patologia14. A taxa de poda sinapse por astrócitos poderosamente é controlada pela ApoE isômeros, com um alelo protetor para AD (ApoE2) fortemente, aumentando a taxa e um alelo de risco para AD (ApoE4), diminuindo significativamente a taxa. Além disso, ratos transgênicos expressando ApoE4 acumularam C1q sináptica muito mais do que controle ou ApoE2 ratos14. Estes dados sugerem que deficientes auditivos fagocitose mediada por astrocyte no início da cérebro AD pode induzir o acúmulo de detritos senescentes C1q-revestido sinapses/sináptica que ativa a fagocitose mediada por complemento microglial, dirigindo a degeneração sináptica . A capacidade fagocitária prejudicada de astrócitos em portadores de ApoE4 também pode contribuir para a descontrolada acumulação de placas de amiloide beta nos cérebros afetados por AD.
Além disso, ficou demonstrado que as células gliais no cérebro envelhecido Drosophila perdem sua capacidade fagocitária devido à diminuição da tradução de Draper, um homólogo de Megf10 que astrócitos usam para fagocitose sinapses. Restaurar níveis Draper resgatou a capacidade fagocitária das células gliais, que eficientemente limpo de detritos axonal danificados no cérebro envelhecido uma medida semelhante que que no cérebro jovem, indicando que envelhecimento induzido por alterações na capacidade fagocítica de astrócitos podem contribuir para interrupção do cérebro homeostase15.
Com base nesses resultados novos, modulando a capacidade fagocitária de astrócitos pode ser uma estratégia terapêutica atraente para prevenir e tratar várias doenças neurológicas. A este respeito, houve várias tentativas de aumentar a capacidade fagocítica dos astrócitos, por exemplo, induzindo a acidificação de lisossomos com nanopartículas de ácido16 e superexpressão do fator da transcrição EB (TFEB), que pode melhorar lisossoma biogênese17. Apesar destas tentativas, é ainda não está claro como astrócitos e células microglial diferem em sua cinética fagocítica e se devemos aumentar ou diminuir sua capacidade fagocitária em várias doenças.
Neste trabalho, apresentamos um ensaio de romance em vitro para detectar a capacidade fagocitária de astrócitos em tempo real. Os dados mostram diferente cinética de absorção e degradação em astrócitos e microglia. Astrocyte-condicionado médio (ACM), que contém fatores secretados de astrócitos, é essencial para a eficaz fagocitose de astrócitos e microglia. Além disso, Megf10, um receptor fagocítica em astrócitos e um homólogo do Ced-1 e Draper, tem um papel crítico na fagocitose mediada por astrocyte8,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, apresentamos os métodos para um longo prazo de imagem ao vivo em vitro fagocitose ensaio usando células gliais purificadas e sinaptossomas conjugada com indicador de pH. Mostramos que, em comparação com microglia, astrócitos possuem capacidade de absorção e degradação diferente durante a fagocitose de sinaptossomas. Além disso, nossos dados sugerem que fatores astrocyte-secretado, que contêm pontes moléculas como proteínas, GAS6 e MEGE8, são essenciais para a fagocitose eficiente de P…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer Jung Joo Yeon dela apoio experimental durante a purificação de synaptosome e parque de Jungjoo para imagens de sinaptossomas com exposição de PS. Além disso, agradecemos a todos os membros no laboratório de Chung para discussão útil. Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de pesquisa de subvenção de Coreia (NRF), financiada pelo governo coreano (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 e 2016R1C1B3006969-NRF) (W.-S. C).
Materials
| Synaptosome purification | |||
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay Kit 2 | BIO-RAD | 5000202 | |
| pH indicator conjugation | |||
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | LPS solution | DMSO100 | |
| pHrodo red, succinimidyl ester | Molecula probes | P36600 | |
| Immunopanning | |||
| 10X Earle’s balanced salt solution (EBSS) | Sigma | E7510 | |
| Bovine serum albumin | Bovogen | BSA025 | |
| Deoxyrebonuclease 1 (DNase) | Worthington | Is002007 | |
| (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| (dPBS) | Welgene | LB001-02 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Griffonia Simplicifolia Lectin(BSL-1) | Vector Labs | L-1100 | |
| Goat anti-mouse IgG+IgM(H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-044 | |
| Goat anti-mouse IgM (μ-chain) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | |
| Heparin-binding epidermal growth factor | Sigma | E4643 | |
| Human HepaCAM antibody | R&D systems | MAB4108 | |
| Integrin beta 5 monoclonal antibody (KN52) | eBioscience | 14-0497-82 | |
| L-cysteine | Sigma | C7880 | |
| L-glutamate | Gibco | 25030-081 | |
| N-acetly-L-cyteine (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal media | Gibco | 21103-049 | |
| O4 hybridoma supernatant(mouse IgM) | Bansal et al.23 | ||
| Papain | Worthington | Is003126 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluristrainer 20 μm | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Purified rat anti-mouse CD45 | BD Pharmingen | 550539 | |
| Purified mouse anti-rat CD45 | BD Pharmingen | 554875 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Trypsin | Sigma | T9935 | |
| Trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |
| Ultra-clear tube (Tube, Thinwall, Ultra-Clear) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Collect IP-ACM | |||
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (10k) | PALL | MAP010C37 | |
| Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane (30k) | PALL | MAP030C37 | |
| Phagocytosis live imaging assay | |||
| Juli stage | NanoEntek | ||
| Time Series Analyzer V3 plugins | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html |
References
- Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).
- Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via GluA1 AMPA receptors. Nature. 486 (7403), 410-414 (2012).
- Xu, J., Xiao, N., Xia, J. Thrombospondin 1 accelerates synaptogenesis in hippocampal neurons through neuroligin 1. Nat Neurosci. 13 (1), 22-24 (2010).
- Chung, W. S., et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways. Nature. 504 (7480), 394-400 (2013).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
- Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
- Parkhurst, C. N., et al. Microglia promote learning-dependent synapse formation through brain-derived neurotrophic factor. Cell. 155 (7), 1596-1609 (2013).
- Iram, T., et al. Megf10 Is a Receptor for C1Q That Mediates Clearance of Apoptotic Cells by Astrocytes. J Neurosci. 36 (19), 5185-5192 (2016).
- Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Astrocytes engage unique molecular programs to engulf pruned neuronal debris from distinct subsets of neurons. Genes Dev. 28 (1), 20-33 (2014).
- Jones, R. S., Minogue, A. M., Connor, T. J., Lynch, M. A. Amyloid-beta-induced astrocytic phagocytosis is mediated by CD36, CD47 and RAGE. J Neuroimmune Pharmacol. 8 (1), 301-311 (2013).
- Wang, Y., et al. TREM2 lipid sensing sustains the microglial response in an Alzheimer’s disease model. Cell. 160 (6), 1061-1071 (2015).
- Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
- Hong, S., et al. Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models. Science. 352 (6286), 712-716 (2016).
- Chung, W. S., et al. Novel allele-dependent role for APOE in controlling the rate of synapse pruning by astrocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (36), 10186-10191 (2016).
- Purice, M. D., Speese, S. D., Logan, M. A. Delayed glial clearance of degenerating axons in aged Drosophila is due to reduced PI3K/Draper activity. Nat Commun. 7, 12871 (2016).
- Loov, C., Mitchell, C. H., Simonsson, M., Erlandsson, A. Slow degradation in phagocytic astrocytes can be enhanced by lysosomal acidification. Glia. , (2015).
- Xiao, Q., et al. Enhancing astrocytic lysosome biogenesis facilitates Abeta clearance and attenuates amyloid plaque pathogenesis. J Neurosci. 34 (29), 9607-9620 (2014).
- Lu, T. Y., et al. Axon degeneration induces glial responses through Draper-TRAF4-JNK signalling. Nat Commun. 8, 14355 (2017).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3 (11), 1718-1728 (2008).
- Stigliani, S., et al. Glia re-sealed particles freshly prepared from adult rat brain are competent for exocytotic release of glutamate. J Neurochem. 96 (3), 656-668 (2006).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Cahoy, J. D., et al. A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).
