Synthese en analyse van de Spectrometrie van de massa van Oligo-peptoids
Summary
Een protocol wordt beschreven voor de handmatige synthese van oligo-peptoids gevolgd door sequentieanalyse door massaspectrometrie.
Abstract
Peptoids zijn reeks bestuurde peptide-nabootsen oligomeren bestaande uit N-Gealkyleerde glycine eenheden. Onder de vele mogelijke toepassingen, hebben peptoids is gedacht als een soort van moleculaire informatieopslag. Analyse van de Spectrometrie van de massa is beschouwd als de methode van keuze voor sequencing peptoids. Peptoids kan worden gesynthetiseerd via vaste fase chemie met behulp van een herhalende cyclus van twee stappen reactie. Hier presenteren we een methode voor het handmatig het synthetiseren van oligo-peptoids en voor het analyseren van de volgorde van de peptoids met behulp van tandem massaspectrometrie (MS/MS) technieken. De peptoid van het monster is een nonamer die bestaat uit afwisselende N-(2-methyloxyethyl) glycine (Nme) en N-(2-phenylethyl) glycine (NFE), evenals een N-(2-aminoethyl) glycine (Nae) op de N-terminus. De formule van de volgorde van de peptoid is Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, waar Ac de acetyl groep. De synthese plaatsvindt in een commercieel beschikbare solid-phase reactievat. De ijsbaan amide hars wordt gebruikt als de solide steun opleveren van de peptoid met een amide-groep op het C-terminus. Het resulterende peptoid product is onderworpen aan sequentieanalyse met behulp van een triple-vierpolige massaspectrometer gekoppeld aan een bron electrospray ionisatie. De meting van de MS/MS produceert een spectrum van fragment ionen als gevolg van de dissociatie van geladen peptoid. De fragment-ionen worden geregeld op basis van de waarden van hun massa-naar-charge ratio (m/z). De m/z-waarden van het fragment-ionen zijn vergeleken met de nominale massa van theoretisch voorspelde fragment ionen, volgens het stelsel van versnippering van de peptoid. De analyse genereert een patroon van de versnippering van de geladen peptoid. Het patroon van fragmentatie is gecorreleerd aan de monomeer opeenvolging van de neutrale peptoid. In dit verband leest MS analyse de gegevens van de volgorde van de peptoids.
Introduction
Peptoids vormen een klasse van sequentie-gecontroleerde polymeren met een ruggengraat structuren nabootsen van de structuur van peptiden. Peptoids kunnen gesynthetiseerd worden uit verschillende amines, waarmee peptoids vertonen zeer afstembare eigenschappen1,2. Peptoids zijn gebruikt als moleculaire modellen voor biofysische onderzoek, beschouwd als therapeutische agenten en ontworpen als liganden voor eiwitten3,,4,,5,6. Peptoids hebben ontwikkeld tot een verscheidenheid van biologisch actieve stoffen, zoals anti-fouling en antilichaam-mimetische materialen, antimicrobiële stoffen en enzym remmers7,8,9. Met een zeer geordende en afstembare aard, hebben peptoids ook gedacht als een soort van moleculaire informatie-opslag10. De ontdekking van deze uiteenlopende toepassingen wordt aangedrongen op de ontwikkeling van efficiënte analytische methoden te karakteriseren van de volgorde en structuur van peptoids. Tandem massa spectrometrie gebaseerde technieken gebleken belofte als de methode van keuze voor het analyseren van de eigenschappen van de reeks van sequentie-gecontroleerde polymeren, peptoids11,12,13, waaronder 14,,15. Echter, systematische studies correleren de peptoid ion fragmentatie patronen als gevolg van massa spectrometrie studies en de structuurgegevens van peptoids zijn zeer beperkt.
Peptoids kan gemakkelijk worden gesynthetiseerd met een vaste fase-methode. De goed ontwikkelde methode houdt een herhaling van een tweestaps monomeer toevoeging cyclus16,17. In elke cyclus van toevoeging, een hars-gebonden amine is geacetyleerd door een haloacetic zuur (meestal Broomazijnzuur, BMA) en dit wordt gevolgd door een reactie van de verplaatsing met een primair amine. Hoewel geautomatiseerde synthese protocollen routinematig voor peptoid synthese toegepast zijn, kan peptoids handmatig worden gesynthetiseerd met een uitstekende opbrengst in een standaard chemie laboratorium16,18,19, 20.
Onze lab heeft de methode voor handmatige peptoid synthese en de apparatuur die wordt gebruikt in de bestaande methoden vereenvoudigd. Wij hebben eerder de patronen van de fragmentatie van een reeks peptoids met behulp van MS/MS technieken21,22,23bestudeerd. Onze resultaten tonen aan dat peptoids karakteristieke breukpatroon produceren wanneer ze worden onderworpen aan botsing-geïnduceerde dissociatie (CID)21,23 of elektron-vangst dissociatie (ECD)22 experimenten. In dit artikel tonen we hoe oligo-peptoids kan worden gesynthetiseerd in een standaard chemie laboratorium, het uitvoeren van de CID-experimenten met behulp van een triple-vierpolige massaspectrometer en hoe om de spectrale gegevens te analyseren. De peptoid worden gesynthetiseerd en gekenmerkt is een nonamer met N-terminal acetylation en C-terminal amidation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2. De structuur van de peptoid is afgebeeld in Figuur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een nonamer peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, heeft zijn gesynthetiseerd met behulp van het protocol gepresenteerd. De synthese apparatuur omvat een reactievat spuit-achtige polypropyleen solid-fase en een mechanisch schudapparaat. De schepen van de reactie zijn commercieel beschikbaar en lage kosten. Een mechanisch schudapparaat is een gemeenschappelijk apparaat in chemie laboratoria. Met het gebruik van een spuit-achtige reactievat, kunnen oplossingen worden getrokken in en uit het schip geduwd door…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank Mr. Michael Connolly en Dr. Ronald Zuckermann (The moleculaire Foundry, Lawrence Berkeley National Laboratory) voor ondersteuning van de techniek in de synthese van peptoid. Wij erkennen de steun van de National Science Foundation (CHE-1301505). Alle massaspectrometrie experimenten werden uitgevoerd in de scheikunde aan de Universiteit van de Stille Oceaan aan de massaspectrometrie faciliteit.
Materials
| ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L | Agilent Technologies Inc. | The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc. | |
| Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software | Varian Inc. | The software is a part of the Varian 320L package | |
| Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD | Fisher Scientific International Inc. | 14-400-126 | |
| Hermle Centrifuge, Model Z 206 A | Hermle Labortechnik GmbH | ||
| Solid phase reaction vessel, 10 mL | Torviq | SF-1000 | |
| Pressure caps for reaction vessels | Torviq | PC-SF | |
| Syringe filters, pore size 0.2 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3B | |
| Syringe filters, pore size 0.45 μm | Fisher Scientific Inc. | 03-391-3A | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL | VWR International, LLC. | 490001-626 | |
| Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL | VWR International, LLC. | 490001-620 | |
| ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0 | CambridgeSoft Corporation | CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc. | |
| Styrofoam cup, 12 Oz | Common Supermarket | ||
| Rink amide resin | Chem-Impex International, Inc. | 10619 | |
| Piperidine | Chem-Impex International, Inc. | 02351 | Highly toxic |
| N, N’-diisopropylcarbodiimide | Chem-Impex International, Inc. | 00110 | Highly toxic |
| Bromoacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 26843 | Highly toxic |
| 2-Phenylethylamine | VWR International, LLC. | EM8.07334.0250 | |
| 2-Methyoxyethylamine | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 241067 | |
| N-Boc-ethylenediamine | VWR International, LLC. | AAAL19947-06 | |
| Acetic anhydride | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 252845 | |
| N, N-dimethylformamide | VWR International, LLC. | BDH1117-4LG | Further distillation before use |
| N, N-diisopropylethylamine | Chem-Impex International, Inc. | 00141 | |
| Triisopropylsilane | Chem-Impex International, Inc. | 01966 | |
| Trifluoroacetic acid | Chem-Impex International, Inc. | 00289 | Highly toxic |
| Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System | Millipore Corporation | ZMQP60001 | For generating HPLC grade water |
| HPLC-grade Water | Produced from Millipore MILLI-Q® Academic Water Purification System | ||
| Methanol | Pharmco-Aaper | 339USP/NF | HPLC grade |
| Acetonitrile | Fisher Scientific International, Inc. | A998-4 | HPLC grade |
| Diethyl ether | VWR International, LLC. | BDH1121-19L | Further distillation before use |
| Dichloromethane | VWR International, LLC. | BDH1113-19L | Further distillation before use |
| Nitrogen gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | NIT 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
| Argon gas | Fresno Oxygen/Barnes Supply | ARG 50-C-F | Ultra high purity, 99.9995% |
References
- Sun, J., Zuckermann, R. N. Peptoid Polymers: A Highly Designable Bioinspired Material. ACS Nano. 7 (6), 4715-4732 (2013).
- Fowler, S. A., Blackwell, H. E. Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function. Org. Biomol. Chem. 7 (8), 1508-1524 (2009).
- Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (8), 2794-2799 (2008).
- Kruijtzer, J. A., Nijenhuis, W. A., Wanders, N., Gispen, W. H., Liskamp, R. M., Adan, R. A. Peptoid-Peptide Hybrids as Potent Novel Melanocortin Receptor. J. Med. Chem. 48 (13), 4224-4230 (2005).
- Liu, B., Alluri, P. G., Yu, P., Kodadek, T. A Potent Transactivation Domain Mimic with Activity in Living Cells. J. Am. Chem. Soc. 127 (23), 8254-8255 (2005).
- Patch, J. A., Barron, A. E. Helical Peptoid Mimics of Magainin-2 Amide. J. Am. Chem. Soc. 125 (40), 12092-12093 (2003).
- Ham, H. O., Park, S. H., Kurutz, J. W., Szleifer, I. G., Messersmith, P. B. Antifouling Glycocalyx-Mimetic Peptoids. J. Am. Chem. Soc. 135 (35), 13015-13022 (2013).
- Olivier, G. K., Cho, A., Sanii, B., Connolly, M. D., Tran, H., Zuckermann, R. N. Antibody-Mimetic Peptoid Nanosheets for Molecular Recognition. ACS Nano. 7 (10), 9276-9286 (2013).
- Olsen, C. A., Ziegler, H. L., Nielsen, H. M., Frimodt-Moeller, N., Jaroszewski, J. W., Franzyk, H. Antimicrobial, Hemolytic, and Cytotoxic Activities of β-Peptoid-Peptide Hybrid Oligomers: Improved Properties Compared to Natural AMPs. ChemBioChem. 11 (10), 1356-1360 (2010).
- Lutz, J. -. F., Ouchi, M., Liu, D. R., Sawamoto, M. Sequence-Controlled Polymers. Science. 341 (6146), 628 (2013).
- Altuntas, E., Schubert, U. S. “Polymeromics”: Mass spectrometry based strategies in polymer science toward complete sequencing approaches: A review. Anal. Chim. Acta. 808, 56-69 (2014).
- Paulick, M. G., Hart, K. M., Brinner, K. M., Tjandra, M., Charych, D. H., Zuckermann, R. N. Cleavable Hydrophilic Linker for One-Bead-One-Compound Sequencing of Oligomer Libraries by Tandem Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 8 (3), 417-426 (2006).
- Thakkar, A., Cohen, A. S., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Pei, D. High-Throughput Sequencing of Peptoids and Peptide-Peptoid Hybrids by Partial Edman Degradation and Mass Spectrometry. J. Comb. Chem. 11 (2), 294-302 (2009).
- Sarma, B. K., Kodadek, T. Submonomer Synthesis of A Hybrid Peptoid-Azapeptoid Library. ACS Comb Sci. 14 (10), 558-564 (2012).
- Li, X., Guo, L., Casiano-Maldonado, M., Zhang, D., Wesdemiotis, C. Top-Down Multidimensional Mass Spectrometry Methods for Synthetic Polymer Analysis. Macromolecules. 44 (12), 4555-4564 (2011).
- Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries. Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).
- Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).
- Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory. J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).
- Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets. J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).
- Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J Vis Exp. (117), (2016).
- Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition. Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).
- Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).
- Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).
